内皮集落形成祖细胞（ECFCs）是研究血管稳态与修复的有力工具1,2。本文介绍一种新型无动物血清的方法，利用混合人血小板裂解物（pHPL）从肝素抗凝的成人外周血中分离并扩增ECFC，从而降低抗牛血清免疫反应的风险。
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本文内容
摘要
摘要
本文介绍了一种从经肝素化但未经其他处理的成人人外周血中回收内皮集落形成祖细胞（ECFCs）的新策略，平均回收时间为12天。经大规模扩增后 >1×108 ECFC 可用于进一步检测。使用 pHPL 的优势在于可避免人类细胞与牛血清抗原的接触。通过流式细胞术和免疫组织化学方法，可将分离的细胞鉴定为 ECFC，并对其 体外 通过Matrigel实验可检测这些细胞形成类似血管结构的功能。此外，还可将这些细胞皮下注射至小鼠模型中，以形成具有功能且可灌注的血管。 体内长期扩增和冻存后，细胞的增殖能力、功能及基因组稳定性均得以维持。 3,4
这种无动物蛋白的分离与扩增方法可轻松应用于大量生成内皮集落形成细胞（ECFCs）。
方案
A.) ECFC 分离
第1天：
- 实验开始前，配制细胞培养基——内皮细胞生长培养基-2（EGM-2）。在500 ml内皮细胞基础培养基-2中加入肝素（1 ml，1000 U/ml）、青霉素/链霉素溶液（5 ml，100x）、L-谷氨酰胺（终浓度2 mM）和50 ml混合人血小板裂解物（pHPL）（以上试剂均来自Sigma，St. Louis, MO；www.sigmaaldrich.com）。然后加入0.2 ml氢化可的松、2 ml hFGF-B、0.5 ml VEGF、0.5 ml EGF、0.5 ml IGF-1和0.5 ml抗坏血酸（以上成分均来自Lonza的SingleQuots试剂盒，Walkersville, MD；http://www.lonzabioscience.com/）。使用0.2 µm孔径的500 ml Millipore真空滤器对培养基进行无菌过滤。由于pHPL可能形成微小凝块，每批培养基可能需要使用两个滤器。将过滤后的EGM-2在水浴中预热至37°C。
- 采集成人外周静脉血5 ml，注入6 ml无防腐剂的肝素钠真空采血管中收集血液样本。血液样本应在采集后两小时内完成处理。
- 在超净工作台中，准备一个带透气盖的75 cm2（T75；Costar）培养瓶、一支25 ml移液管和两支5 ml移液管。
- 用25 ml移液管将15 ml预热的含补充成分的EGM-2加入培养瓶中。打开血样管，用一支5 ml移液管将全部5 ml血液转移至培养瓶中。再用另一支5 ml移液管加入5 ml额外的EGM-2冲洗空血样管。T75培养瓶中的总体积为25 ml。拧紧培养瓶的透气盖，置于37°C、5% CO2、95%湿度的培养箱中培养24小时。
第2天：
- 大约24小时（过夜）后，应移除培养基-血液混合物，以去除未贴壁的细胞。为此，在超净工作台中准备两支25 ml移液管和三支5 ml移液管，并将前一天配制的20 ml添加物补充的EGM-2培养基以及30 ml PBS在水浴中预热至37°C。
- 从培养箱中取出装有样本的培养瓶，用25 ml移液管吸除全部上清液。操作时注意不要刮伤瓶壁表面，以免损伤可能存在的细胞克隆。用10 ml预热的PBS轻轻冲洗培养瓶内壁贴壁细胞表面三次，每次通过轻轻倾斜培养瓶使液体从一侧流至另一侧进行清洗。每次冲洗后立即吸除PBS并弃去。
- 向培养瓶中加入20 ml新鲜预热的EGM-2培养基，然后将其放回培养箱中。此操作应尽可能迅速且轻柔，以防止已贴壁细胞脱落。若ECFC在PBS中或室温下放置过久，容易发生脱落。
- 从第2天开始，每隔一天系统性地检查培养瓶，使用光学显微镜的低倍镜观察是否存在ECFC克隆的生长。发现克隆后，应在培养瓶外侧顶部标记其位置。注意培养瓶在培养箱外停留时间不得超过5分钟。
第5天：
- 接种后第五天，进行完全换液以去除未贴壁细胞。为此，将20 ml EGM-2培养基在37°C水浴中预热，并准备两支25 ml移液管。
- 使用25 ml移液管吸除旧培养基，并尽快加入新鲜的、预热的含补充剂EGM-2培养基。细胞暴露于无培养基状态的时间不应超过1分钟，以避免干燥。随后将培养瓶放回培养箱，并每日重复观察培养瓶中的细胞状态。
- 每周两次更换30%的培养基，补充新鲜的含补充剂EGM-2培养基以维持细胞生长。
第14-28天：
- 具有铺路石样形态的典型集落约在第12天出现。在培养瓶外侧顶部做标记，以指示每个集落的位置。除非有单个细胞开始脱落，否则让集落继续生长至第28天。一旦鉴定出原代集落，可根据其大小在第14至28天之间进行收获。
B.) 内皮集落形成细胞收获
- 预先将 5 ml 0.05% 胰蛋白酶/EDTA、20 ml PBS 和 5 ml 新鲜添加物补充的 EGM-2 培养基预热。
- 将培养瓶中的培养基完全转移至 Falcon 管中（注意不要触碰培养瓶内表面，以免损伤可能存在的细胞克隆），并用 10 ml 预热的 PBS 轻柔洗涤细胞。
- 加入 5 ml 胰蛋白酶/EDTA，于培养箱中孵育 5 分钟。细胞暴露于胰蛋白酶的时间不应超过 7 分钟，否则会产生毒性。轻轻敲击培养瓶侧面有助于细胞脱落。加入约 10 ml 保存的使用过的培养基以终止胰蛋白酶的蛋白酶活性。
- 将细胞悬液转移至 50 ml Falcon 管中。用 10 ml PBS 洗涤培养瓶一次，洗涤液一并加入收集的细胞悬液中。在 4°C 下以 300 g 离心 7 分钟，收集细胞并去除胰蛋白酶。弃去上清液，立即将细胞沉淀重悬于 1 ml PBS 中，并置于冰上保存。
- 按照 R. Ricardo 和 K. Phelani 在 JoVE 协议中所述方法测定细胞数量。5
C.) ECFC 扩增
- 按照 A 1.1) 中所述补充 500 ml EGM-2 培养基，并在水浴中预热至 37°C。
- 为约 2500 cm2 的培养面积，准备 11 个 T220（225 cm2）或 15 个 T175（175 cm2）培养瓶，或一个四层细胞工厂（CF-4；Nunc, Naperville, IL；http://www.nuncbrand.com）。此外，在超净台中还需准备两个新的透气盖和一个专用无菌漏斗。
- 为使内皮集落形成细胞（ECFCs）的初始接种密度达到 100 c/cm2，需先计算所需细胞数量。对于一个 CF-4，将 252,800 个细胞重悬于 500 ml 新鲜 EGM-2 培养基中，使用无菌漏斗将其加入 CF-4。用透气盖封闭其中一个通气口，将 CF-4 向一个纵向侧倾斜，使培养基在四层之间均匀分布。然后将容器回正，打开透气盖的盖子，将 CF-4 放入培养箱中。
- 每周至少更换一次 20% 的培养基，直至 CF-4 中细胞融合。
- 按照 B.) 中所述方法收获细胞，使用 70 ml 胰蛋白酶/EDTA 和约 200 ml PBS。
代表性结果
采用该分离方法，我们在第12天观察到原代集落形成。在之前的一项研究中，我们能够从每毫升外周血中平均回收4.0 ± 0.8个ECFC集落4。ECFC表现出典型的鹅卵石样形态。在大规模扩增后，以100个细胞/cm2的接种密度，从3名男性和1名女性志愿者（年龄在26至50岁之间）中，约30天内共获得超过1 × 108个细胞。
在这些条件下培养的ECFC被证明具有增殖能力、功能完整且基因组稳定。4 此外，细胞可在含10% DMSO的条件下冻存于液氮中，以供后续使用。3,4
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讨论
这种新型的分离与扩增方法是一种简单高效的流程，通过避免任何细胞分离步骤（无需密度梯度离心），比传统技术更高效、更省时，且成本更低。使用人血小板裂解物（pHPL）可排除其与牛抗原接触以及潜在的异种免疫反应风险。在培养期间，可能因pHPL的使用而形成少量微小凝块。根据我们的经验，这些凝块不会影响细胞克隆形成、细胞增殖或功能。
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致谢
作者感谢 Katharina Schallmoser 博士提供 pHPL，以及 Margaretha Frühwirth 和 Daniela Thaler 提供出色的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 内皮细胞基础培养基-2 | Lonza Inc. | 500 ml | |
| EGM-2 SingleQuots | Lonza Inc. | EGF、hFGF-B、VEGF、IGF-1、氢化可的松、抗坏血酸 | |
| 无防腐剂肝素 | Biochrom AG | 10U/ml per EGM-2 | |
| L-谷氨酰胺 | Sigma-Aldrich | 2 mM 每 EGM-2 | |
| 青霉素和链霉素 | Sigma-Aldrich | 100 U/mL 青霉素和 100μg/mL 链霉素每 EGM-2 | |
| 胰蛋白酶/1 mM EDTA | Invitrogen | 7 ml 用于 T75 培养瓶 70 ml 用于 CF-4 | |
| PBS | |||
| 四层细胞工厂（CF-4） | 康宁 | ||
| 无菌漏斗 | 康宁 | ||
| T75cm²2 培养瓶（带透气盖） | 康宁 | ||
| 6 mL 真空采血管（无防腐剂的肝素钠） | BD Biosciences | 预装有 108 IU/6ml 的 无防腐剂的肝素钠 | |
| 50 ml Falcon管 | Falcon BD | ||
| 5 ml 离心管 | Costar | ||
| 25 ml Stripetts | Costar | ||
| 压片器 | Costar | ||
| 0.2 微米孔径无菌滤器 | EMD Millipore | 每份 EGM-2 使用 2 × 500 ml |
参考文献
- Solovey, A., Lin, Y., Browne, P., Choong, S., Wayner, E., Hebbel, R. P. Circulating activated endothelial cells in sickle cell anemia. N Engl J Med. 337, 1584-1590 (1997).
- Yoder, M. C., Mead, L. E., Prater, D. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
- Schallmoser, K. Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum. Tissue Eng Part C Methods. 14, 185-196 (2008).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. , (2009).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. , (2008).
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重印与许可
