成人人类内皮集落形成祖细胞的分离与大规模扩增

摘要

内皮集落形成祖细胞（ECFCs）是研究血管稳态与修复的有力工具^1,2。本文介绍一种新型无动物血清的方法，利用混合人血小板裂解物（pHPL）从肝素抗凝的成人外周血中分离并扩增ECFC，从而降低抗牛血清免疫反应的风险。

摘要

本文介绍了一种从经肝素化但未经其他处理的成人人外周血中回收内皮集落形成祖细胞（ECFCs）的新策略，平均回收时间为12天。经大规模扩增后 >1×10⁸ ECFC 可用于进一步检测。使用 pHPL 的优势在于可避免人类细胞与牛血清抗原的接触。通过流式细胞术和免疫组织化学方法，可将分离的细胞鉴定为 ECFC，并对其 体外 通过Matrigel实验可检测这些细胞形成类似血管结构的功能。此外，还可将这些细胞皮下注射至小鼠模型中，以形成具有功能且可灌注的血管。 体内长期扩增和冻存后，细胞的增殖能力、功能及基因组稳定性均得以维持。 ^3,4

这种无动物蛋白的分离与扩增方法可轻松应用于大量生成内皮集落形成细胞（ECFCs）。

方案

A.) ECFC 分离

第1天：

1. 实验开始前，配制细胞培养基——内皮细胞生长培养基-2（EGM-2）。在500 ml内皮细胞基础培养基-2中加入肝素（1 ml，1000 U/ml）、青霉素/链霉素溶液（5 ml，100x）、L-谷氨酰胺（终浓度2 mM）和50 ml混合人血小板裂解物（pHPL）（以上试剂均来自Sigma，St. Louis, MO；www.sigmaaldrich.com）。然后加入0.2 ml氢化可的松、2 ml hFGF-B、0.5 ml VEGF、0.5 ml EGF、0.5 ml IGF-1和0.5 ml抗坏血酸（以上成分均来自Lonza的SingleQuots试剂盒，Walkersville, MD；http://www.lonzabioscience.com/）。使用0.2 µm孔径的500 ml Millipore真空滤器对培养基进行无菌过滤。由于pHPL可能形成微小凝块，每批培养基可能需要使用两个滤器。将过滤后的EGM-2在水浴中预热至37°C。
2. 采集成人外周静脉血5 ml，注入6 ml无防腐剂的肝素钠真空采血管中收集血液样本。血液样本应在采集后两小时内完成处理。
3. 在超净工作台中，准备....

讨论

这种新型的分离与扩增方法是一种简单高效的流程，通过避免任何细胞分离步骤（无需密度梯度离心），比传统技术更高效、更省时，且成本更低。使用人血小板裂解物（pHPL）可排除其与牛抗原接触以及潜在的异种免疫反应风险。在培养期间，可能因pHPL的使用而形成少量微小凝块。根据我们的经验，这些凝块不会影响细胞克隆形成、细胞增殖或功能。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
内皮细胞基础培养基-2	Lonza Inc.		500 ml
EGM-2 SingleQuots	Lonza Inc.		EGF、hFGF-B、VEGF、IGF-1、氢化可的松、抗坏血酸
无防腐剂肝素	Biochrom AG		10U/ml per EGM-2
L-谷氨酰胺	Sigma-Aldrich		2 mM 每 EGM-2
青霉素和链霉素	Sigma-Aldrich		100 U/mL 青霉素和 100μg/mL 链霉素每 EGM-2
胰蛋白酶/1 mM EDTA	Invitrogen		7 ml 用于 T75 培养瓶 70 ml 用于 CF-4
PBS
四层细胞工厂（CF-4）	康宁
无菌漏斗	康宁
T75cm²2 培养瓶（带透气盖）	康宁
6 mL 真空采血管（无防腐剂的肝素钠）	BD Biosciences		预装有 108 IU/6ml 的 无防腐剂的肝素钠
50 ml Falcon管	Falcon BD
5 ml 离心管	Costar
25 ml Stripetts	Costar
压片器	Costar
0.2 微米孔径无菌滤器	EMD Millipore		每份 EGM-2 使用 2 × 500 ml