分析型超速离心机（AUC）样品池用于盛装样品和参考缓冲液，在实验过程中暴露于高真空环境，并以高达 60,000 rpm 的转子速度运行。本视频将演示组装、加样和校准这一 AUC 实验关键组件时所需的高度细致操作。
本文内容
摘要
摘要
分析型超速离心机（AUC）是一种强大的生物物理工具，可让我们在高速离心过程中记录大分子的沉降轮廓。若实验设计合理并正确执行，AUC沉降速度或沉降平衡实验能够揭示蛋白质的诸多特性，包括分子大小与形状、样品纯度、沉降系数、寡聚状态以及蛋白质-蛋白质相互作用。
然而，该技术需要极为严格的技术操作。样品池包含一个位于两个窗组件之间的扇形中心池。它们通过约 120–140 in/lbs 的扭矩压力进行密封。参考缓冲液和样品被加载至中心池的扇形区域，密封后，将样品池精确地安装到钛转子中，使光学检测系统在旋转过程中沿每个中心池扇区的径向路径中线同时扫描样品和参考缓冲液，转速可高达 60,000 rpm，并在高真空条件下进行。
正确的样品池组装不仅至关重要，而且样品池组件价格昂贵，必须妥善维护，以确保其处于最佳工作状态，从而避免实验过程中发生泄漏或破损。操作窗片时需格外小心，因为即使是最轻微的裂纹或划痕，也可能导致在离心过程中窗片破裂。中心组件与窗片之间的接触必须尽可能紧密；即施加扭矩压力后不应出现牛顿环。窗片或中心组件上的灰尘、纤维、划痕和油渍均会破坏这种紧密接触，极易导致溶液从一个扇区泄漏到另一个扇区，甚至完全从中心组件中漏出。这不仅会造成珍贵样品的损失，实验过程中的溶液泄漏还会引起样品池内压力失衡，常常导致窗片和中心组件破裂。此外，堵头密封圈和外壳堵头必须牢固安装，以防止离心机腔体内的高真空通过加样孔将溶液从中心组件扇区中抽出。窗片衬垫和密封圈必须无任何断裂或裂纹，以免因发生位移而导致窗片破裂。
本视频将演示我们在完美AUC实验中为尽量减少组件损坏、溶液泄漏和破裂而采用的样品池组装、扭矩、加载和转子对齐操作流程。
方案
样品细胞组装与扭矩
- 我们通过组装两个窗片组件开始样品池的构建。
将窗片密封圈放入窗片支架中。将窗片衬垫（有时也称为窗片垫圈）放置在窗片支架内部，使衬垫的开口与支架的键槽相对。以轻微倾斜的角度，将窗片放入支架中，使窗片上的刻线标记与窗片支架的键槽对齐。轻轻按压窗片两侧的最边缘处。 - 为确保样品池的密封性及施加准确的扭矩，我们需在池体密封圈和螺纹环上均匀涂抹少量Spinkote润滑剂。取极少量Spinkote润滑剂于拇指与食指间搓匀。在螺纹环的螺纹上涂覆一层薄至不可见的Spinkote薄膜。同样地，将池体密封圈也进行涂覆。擦去所有可见的润滑剂残留。
- 开始组装样品池时，将一个窗片朝上（面向您）的窗片组件滑入池体中，使键槽与池体上的键对齐。将中心件的键槽与池体键对齐，然后轻轻将其放置在池内窗片组件的上方。
- 切勿使用任何工具将中心件推入池体中，这可能导致中心件（CP）永久性损坏，从而在实验过程中发生泄漏。将第二个窗片组件旋转至窗片朝向中心件（即背向您），使键槽与池体键对齐，然后将其滑下并放置在中心件上方。在其顶部放置一个池体密封圈，再放上螺纹环，确保“Out”字样可见。使用手指配合对准工具，手动拧紧螺纹环。
如果中心件（CP）难以顺利滑入池体筒内，可先将其对齐，然后将第二个窗片组件放置在其上方。通过轻轻向下按压窗片组件，同时将两者一起滑入池体中。这样可以避免直接对中心件施加压力。
此时应检查池内是否有灰尘、纤维或指纹。您可能还会观察到牛顿环，这表明中心件与窗片之间仍存在空气。施加扭矩后这些环将消失。 - 将样品池放入扭矩台的扭矩夹头中，确保螺纹环朝上且“Out”字样可见，并完全插入到底。通过持续按压扭矩台手柄固定样品池。一次性连续施力，将螺纹环拧紧至120–140 in-lbs的扭矩范围。若使用可调式测微扭矩扳手，请将其设定在120–140 in/lbs之间，并拧紧螺纹环直至扳手发出“咔哒”声，表示已达到设定扭矩。松开扭矩台手柄，并小心取出样品池，避免触碰窗片。
样品池的装载与密封
- 对于沉降速度实验，我们通常使用 200 µl 移液器将 400 µl 体积的溶液加入 12 mm 沉降池的每个扇形区域中。将样品池放置为加样孔朝上，且螺环上的“out”字样可见。将移液器吸头从加样孔插入至中心单元左侧扇区约一半深度，缓慢加入 200 µl 参比溶液，重复一次，共计 400 µl。使用同一移液器吸头和相同技术，仔细且缓慢地向中心单元右侧扇区加入 400 µl 样品溶液。
沉降平衡实验使用 150–180 µl 的体积，但应遵循相同的谨慎操作和技术。
参比溶液与样品溶液的体积必须尽可能匹配。将移液器吸头牢固安装在移液器上，缓慢加样和排液，避免引入气泡，并对两种溶液使用同一吸头，这些措施均有助于使体积尽可能相等。 - 通过将两个新的红色外壳密封垫圈紧密地插入每个加样孔中来密封样品池，确保垫圈位于中心单元与铝制外壳之间。每个孔上覆盖一个外壳塞，用手拧紧，必要时使用小型一字螺丝刀辅助紧固。
转子中样品细胞的排列
- 在装载转子之前，确保平衡管的重量比相对位置的样品管轻不超过0.5 g，以防样品管发生泄漏。开始前先将天平归零。首先称量将放置在平衡管对侧位置的样品管。将该样品管的重量通过去皮归零扣除后，再称量平衡管。通过在平衡管的附加孔中增减重量进行调节，确保所加重量不从顶部突出。重新称重，确保平衡管的最终重量比相对位置的样品管轻不超过0.5 g。
- 使用四孔转子时，将平衡管放入4号位置，使白色箭头可见并指向离心力方向。确保平衡管完全插入转子内部。轻轻拧紧位于平衡管顶部、白色箭头对面的固定螺钉，使平衡管牢固就位，但仍可进行对齐调整。将已平衡的样品管放置时，使外壳插头朝向转子中心，并确保螺环上的“out”字样可见。
- 从转子底部观察，使用对齐工具将平衡管上的刻线标记与转子内侧刻线（靠近转子中心的刻线）对齐。拧紧固定螺钉，将已对齐的平衡管锁定到位。以同样方式，将样品管上的刻线标记与转子2号位置的内侧刻线对齐。
欲了解更多信息，请访问 https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx
讨论
正确的样品池组装、样品插入以及在转子中的样品池对齐对于高质量的分析超速离心（AUC）实验至关重要。这一点在需要对大分子沉降轮廓的采集数据进行非常详细分析的实验中尤为突出，例如在研究蛋白质相互作用或测定痕量聚集体含量时。实验装置的质量常常限制了AUC研究结果的准确性和精密度。有关AUC实验的实际设计及进一步操作的详细信息，请参见参考文献1–3。我们在中国台湾的国家卫生研究院实验室每年举办两次关于AUC实验实际操作、理论及数据分析的培训班[4]。
致谢
我们感谢美国国立卫生研究院（NIH）国家生物医学成像与生物工程研究所（NIBIB）院内研究计划提供的研究支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4 孔钛分析转子 | Beckman Coulter Inc. | 361964 | |
| 扭矩支架组件 | Beckman Coulter Inc. | 361318 | |
| 样品池对准工具 | Beckman Coulter Inc. | 362340 | |
| Spinkote 润滑剂 | Beckman Coulter Inc. | 306812 | |
| 平衡配重块 | Beckman Coulter Inc. | 360219 | |
| 样品池外壳套件 | Beckman Coulter Inc. | 334602 | |
| 窗片密封圈 | Beckman Coulter Inc. | 327021 | |
| 窗片衬垫 | Beckman Coulter Inc. | 362329 | |
| 蓝宝石窗片 | Beckman Coulter Inc. | 307177 | |
| 石英窗片 | Beckman Coulter Inc. | 301730 | |
| 窗片固定环 | Beckman Coulter Inc. | 305037 | |
| 12 mm 双通道环氧中心组件 | Beckman Coulter Inc. | 306493 | |
| 样品池塞密封圈 | Beckman Coulter Inc. | 327022 | |
| 样品池外壳塞 | Beckman Coulter Inc. | 362327 |
参考文献
- Brown, P. H., Balbo, A., Schuck, P. Characterizing protein-protein interactions by sedimentation velocity analytical ultracentrifugation. Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.15-Unit 18.15 (2008).
- Balbo, A., Brown, P. H., Braswell, E. H., Schuck, P. Measuring protein-protein interactions by equilibrium sedimentation. Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.8-Unit 18.8 (2007).
- analytical ultracentrifugation direct boundary modeling with sedfit [Internet]. , Peter Schuck. Available from: http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm Forthcoming.
- Home - Workshops [Internet]. , National Institutes of Health. Available from: https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx Forthcoming.
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