用于表面固定生物分子单分子荧光测量的自动化系统

摘要

本文中，我们描述了如何利用自动扫描共聚焦显微镜，从固定在表面的单个DNA分子获得FRET轨迹。

摘要

荧光共振能量转移（FRET）显微技术已被广泛用于研究核酸和蛋白质等生物分子的结构与动态。对固定化分子进行单分子FRET（sm-FRET）测量，可实现对系统长时间的观测——直至两种染料均发生光漂白——从而获得反映生物分子动力学的时间轨迹，其时间尺度覆盖毫秒至分钟范围。为便于获取大量轨迹数据以进行统计分析，整个过程必须实现自动化，并在整个测量期间（约12小时）严格控制样品环境。这可通过自动化扫描共聚焦显微镜实现，该系统可在夜间连续检测数千个单分子；同时结合微流控芯片，实现缓冲液的可控更换、限制氧气含量，并在整个测量过程中维持恒定温度。本文将展示微流控装置的组装方法及其表面活化以固定DNA的步骤，随后说明如何配制缓冲液以最大程度提高荧光染料的光稳定性和寿命，最后介绍准备实验装置以自动采集DNA分子时间分辨单分子FRET轨迹的具体步骤。 关键词：荧光共振能量转移，单分子FRET，sm-FRET，共聚焦显微镜，微流控装置，DNA固定，光稳定性，时间轨迹，自动化数据采集，生物分子动力学

方案

1 - 组装微流控芯片

微流控细胞由一个图案化的、2 mm厚的聚二甲基硅氧烷（PDMS）圆盘与一片 freshly cleaned 石英盖玻片键合而成。该PDMS圆盘包含四个30 μl的矩形腔室，腔室通过入口和出口的柔性毛细管分别连接至缓冲液储液池和注射泵，以实现缓冲液的可控流动。流动池背面由一片玻璃窗支撑，并放置在定制的细胞支架上，该支架包含一个水冷式热电元件，用于调节温度。

1. 制备图案化PDMS圆盘时，将10份硅弹性体基质与1份固化剂混合均匀，并在真空条件下脱气1小时。
2. 将混合好的弹性体溶液轻轻倒入微流控细胞模具中。在本实验中，模具为一片直径1英寸的硅片，其上由负性光刻胶制成四条微结构（尺寸为1×10⁴ × 1×10³ × 300 μm）。将该模具置于70°C加热板上固化2小时。
3. 使用剃刀小心地将固化的PDMS圆盘从模具上剥离。通过等离子体氧化处理PDMS圆盘和1英寸玻璃窗（玻璃窗两端各含有8个直径为2 mm的预钻孔）表面30秒，然后将玻璃窗键合到PDMS圆盘的平整面（即无微通道的一面）。
4. 将一段长约2英寸的柔性熔融石英毛细管从每个玻璃窗的孔中插入，直至其进入微通道。可先插入一根针头引导，再插入毛细管，以利于操作。使用快速固化的硅胶封装材料（如Kwik-Cast）密封玻璃窗上的孔。
5. 用乙醇和水冲洗微通道，并将组装好的芯片与一块新清洁的1英寸圆形石英盖片一同进行等离子体活化处理30秒。建议使用piranha溶液清洁该盖片。将盖片键合至芯片带有微通道的一侧，以密封反应腔室。
6. 将组装完成的芯片在室温下静置过夜，使其充分固化。

* Piranha 是由 H₂O₂ 和 H₂SO₄ 按 1:2.5 比例配制的溶液。清洁盖玻片时，将其浸入 Piranha 溶液中，在 90°C 下处理 20 分钟。

2 - 激活表面以固定分子

在核酸研究中，最简单的表面固定方法是首先将生物素化的牛血清白蛋白（BSA）包被在玻璃或石英盖玻片上，然后包被链霉亲和素。这种方法可使生物素化的样品在室温下高度特异性地固定数天。

1. 将柔性管路连接至毛细管，以便使用注射器和针头轻松注入缓冲液。
2. 将含有 0.1 mg/ml 生物素化 BSA 的溶液溶于缓冲液 A（10 mM TRIS-HCl，pH 8.0，50 mM NaCl，使用 0.02 μm 滤器过滤）中，注入通道，并孵育至少 30 分钟。
3. 用 300–500 μl 缓冲液 A 流经通道，以去除通道中未结合的生物素化 BSA，注意避免在腔室内滞留气泡。
4. 注入含有 0.1 mg/ml 链霉亲和素的缓冲液 A 溶液，孵育 15 分钟，然后重复步骤 3。
5. 流经含 3–5 pM 生物素化样品的溶液。进行表面扫描以检测荧光分子的覆盖度。如有必要，可提高样品浓度以获得更佳覆盖。孵育 10 分钟后，重复步骤 3。

微流控芯片安装在电动化X-Y平台上，该平台利用光学编码直流电机实现粗调（最大25 mm）运动，以及利用两个闭环压电致动器（Physik Instrumente型号M-014或类似产品）实现精细（1 nm）运动。此操作可在激活表面以固定样品之前或之后进行。

3 - 准备成像缓冲液（IB）

成像缓冲液（IB）包含一种酶促耗氧系统和一种三重态猝灭剂（如Trolox）。由于IB需持续过夜灌流，因此应预先准备至少10 ml。

1. 配制 10 ml 含 0.8% w/v D-葡萄糖、至少 35 mM TRIS-HCl（pH 8.0）和 50 mM NaCl 的去离子水溶液。缓冲液浓度较高的原因有两点：Trolox 的溶解会使溶液酸化，且酶促反应会随时间推移降低溶液的 pH。由于该溶液具有较长的保存期限，可作为储备液储存。
2. 将5 mg Trolox溶于步骤1中制备的缓冲液中，涡旋震荡数分钟，随后振荡混合 >10 分钟。Trolox 在 pH 值下的水中溶解度不高 > 7，因此请勿急于完成此步骤。使用滤器过滤溶液 0.2 μm 过滤后在真空条件下脱气10分钟。
3. 通过混合制备“gloxy”酶溶液 60 μl 水 20 μl 5X 缓冲液 A 20 μl 过氧化氢酶，1 毫克葡萄糖氧化酶和 100 μl 10 mg/ml BSA溶液，使用滤器过滤该溶液 0.22 μm 离心过滤器
4. 将第2步的缓冲液与第3步的“gloxy”溶液轻轻混合，避免产生气泡。
5. 以恒定流速将 IB 流过通道 5 μl/min 使用机械注射泵控制流速。向IB储液槽中通入氩气气泡，以防止空气中的氧气重新溶解到缓冲液中。

表面扫描、分子定位以及单分子荧光强度轨迹的采集由一个 LabView 程序控制，该程序可实现自动化数据采集¹。该程序以 0.2 μm 的分辨率对 20×20 μm² 的区域进行扫描，扫描速率为 0.1 μm/ms。数据会立即被处理，以获得所有高于背景计数的像素点的强度加权位置。一旦找到固定的分子，它们将被逐一移入共聚焦体积中，并记录供体和受体荧光染料的强度随时间的变化，直至两个荧光染料均发生光漂白。随后，程序控制载物台移动到距离原点 100 μm 的新位置，并重复扫描过程。

4 - 代表性结果

以下是一些图像，展示了组装好的微流控芯片在表面活化前以及安装到显微镜上准备进行分子固定后的状态。如果通道成功活化，表面扫描结果应与下图所示类似，在直接激发供体染料后，可观察到供体（绿色）和受体（红色）的荧光发射。这些分子逐一进入探测区域，其荧光信号随时间被记录，直至两个染料均发生光漂白，如单分子轨迹图所示。通过此类轨迹可计算出FRET效率，从而反映供体与受体之间的瞬时距离，进而用于研究具有生物学意义的分子的结构与动态特性。

图1： 具有四个通道的微流控细胞，每个通道均带有进样/出样毛细管。请点击此处查看图1的放大版本。

图2： 安装在显微镜上、准备进行测量的细胞。请点击此处查看图2的放大版本。

图3： 单分子FRET测量实验装置。请点击此处查看图3的放大版本。

图4和图5：用绿色激光激发的固定化FRET分子表面扫描的红色和绿色通道图像。请点击查看图4或图5的放大版本。

图6、图7、图8和图9： 标记在相距8、10、16和18个碱基对的DNA分子上的供体（绿色）和受体（红色）荧光团的强度轨迹。请点击以下链接查看更大版本的图6、图7、图8或图9。

讨论

尽管上述方案已针对我们的特定系统以及特定染料（TMR 和 ATTO647N）进行了优化，但它绝不是唯一经过验证的方法。最近，一种由原儿茶酸（PCA）和原儿茶酸-3,4-双加氧酶（PCD）组成的替代性除氧系统被证明可提高某些染料的光稳定性⁴。同样，也可使用其他三重态猝灭剂如β-巯基乙醇（BME）替代Trolox，但这些试剂可能无法抑制某些染料（特别是Cy5）的长时间闪烁现象⁵。

尽管通过生物素-链霉亲和素-生物素化牛血清白蛋白（BSA）进行固定是核酸研究的首选方法，但聚乙二醇（PEG）包被的表面更适用于蛋白质研究，因为它可防止非特异性吸附¹。此外，在目标生物分子可能受到表面相互作用影响的情况下，可使用小于衍射极限尺寸的囊泡来包封该生物分子⁶。

本文中，我们采用配备硅光电倍增管的共聚焦装置来获取荧光强度轨迹。该方案同样适用于配备CCD相机的全内反射荧光显微镜（TIRF）。无论使用何种显微技术，只要对供体和受体信号进行适当校正，单分子FRET即可提供接近埃级（angstrom）的空间分辨率信息⁷。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
熔融石英毛细管	Polymicro Technologies	TSP150375
熔融石英盖玻片	Esco Products	R425000
管路	Diba Industries
生物素标记的牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A8549
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A9085
链霉亲和素	Thermo Fisher Scientific, Inc.	0021122
Sylgard 184 弹性体试剂盒	Dow Corning	3097366-1004	硅酮弹性体试剂盒
Trolox	Aldrich	238813
过氧化氢酶	Sigma-Aldrich	C3155
葡萄糖氧化酶	Sigma-Aldrich	G2133
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G7528
Kwik-Cast 封固剂	World Precision Instruments, Inc.	Kwik-Cast	硅胶浇铸化合物