通过荧光激活细胞分选（FACS）纯化特定细胞群体

摘要

对于需要对细胞群体进行生物学和化学分析的许多科学研究而言，细胞必须具有高纯度。荧光激活细胞分选（FACS）是获取高纯度细胞群体的优越方法。

摘要

实验和临床研究通常需要高度纯化的细胞群体。流式细胞荧光分选（FACS）是一种用于纯化已知表型细胞群体的首选技术。其他批量纯化方法包括平板黏附法（panning）、补体耗竭法和磁珠分离法。然而，FACS 相较于其他现有方法具有多项优势。当需要极高纯度的目标细胞群体、目标细胞群体表达极低水平的鉴定标志物，或需要根据标志物表达密度差异进行细胞分选时，FACS 是首选方法。此外，FACS 是目前唯一可用于基于细胞内染色或胞内蛋白表达（如基因修饰的荧光蛋白标记物）进行细胞分离的纯化技术。FACS 可根据细胞的大小、颗粒度和荧光特性实现单个细胞的纯化。为了纯化目标细胞，首先需使用荧光标记的单克隆抗体（mAb）对细胞进行染色，这些抗体可识别目标细胞群体表面的特异性标志物（1）。未染色细胞的阴性筛选也是可行的。FACS 纯化需要配备分选功能的流式细胞仪及相应的软件支持。在 FACS 过程中，悬浮细胞以液滴流的形式通过激光束，每个液滴通常包含单个细胞。荧光检测系统根据预先设定的细胞荧光参数识别目标细胞。仪器对含有目标细胞的液滴施加电荷，随后通过静电偏转系统将带电液滴引导至相应的收集管中（2）。染色及分选的成功在很大程度上取决于鉴定标志物的选择以及单克隆抗体的选用。分选参数可根据对纯度和得率的要求进行调整。尽管 FACS 需要专用设备和专业人员培训，但它仍是获得高度纯化细胞群体的首选方法。

方案

1. 开始操作前，需准备以下物品：
   1. 冰
   2. 用于染色细胞的 15 ml 锥形管，以及用于单色对照染色的 12 × 75 mm 流式管
   3. 染色缓冲液：磷酸盐缓冲液（PBS）+ 3% 胎牛血清（FCS）
   4. 移液器
   5. Fc 阻断剂（如需要）及染色用抗体。抗体需经滴定以确定最佳染色浓度
   6. 补偿微珠
   7. 悬浮缓冲液：Hank's 平衡盐溶液（HBSS）+ 25 mM HEPES + 3% FCS
   8. 台盼蓝和血细胞计数板
   9. 细胞筛（40 μm 尼龙）
   10. 收集管：可使用两种类型的收集管 a) 12 × 75 mm 聚苯乙烯管（内含 300 μl FCS 和 25 mM HEPES）或 b) 15 ml 锥形管（内含 1 ml FCS + 25 mM HEPES）。任何富含高浓度血清的培养基均可用于收集分选后的细胞
2. 将起始细胞群体制备成单细胞悬液
3. 可选步骤：通过补体耗竭或磁珠分选等批量纯化方法富集目标细胞群体。富集步骤的主要优势在于可缩短分选时间
4. 用染色缓冲液洗涤细胞一次
5. 弃去上清液，将细胞重悬于染色缓冲液中，浓度最高可达 50 × 10⁶，以实现高效染色
6. 可选步骤：对于表达高水平 FcR 的细胞，使用适当的阻断方法封闭受体。常用方法为在冰上使用可结合 FcγR 的单克隆抗体孵育 10–15 分钟。此类抗体可从商业途径获得
7. 加入适当浓度的单克隆抗体（mAb）以标记目标细胞群体，在避光冰浴中孵育 20–30 分钟，随后用染色缓冲液洗涤两次。可选步骤：可加入活体染料（如碘化丙啶）进行染色以区分死细胞（5）。若进行多色染色，需设置单色对照。我们使用 BD CompBeads，按照制造商说明书制备单色对照
8. 若未使用直接偶联抗体，则使用适当的二抗或链霉亲和素偶联物重复步骤 7
9. 洗涤后，将细胞重悬于培养基中，并使用台盼蓝等活体染料测定细胞浓度
10. 将细胞浓度调整至 15–20 × 10⁶/ml。对于易形成细胞团簇、可能在分选过程中堵塞仪器的细胞群体，需通过滤网过滤
11. 设置并优化细胞分选仪。流式细胞仪的设置因制造商而异，需由经过适当培训的人员操作。
    一般建议如下：
    1. 根据待分选细胞类型选择合适的喷嘴
    2. 如需无菌分选，应对仪器进行灭菌处理
    3. 使用微珠进行仪器质控，以确认激光正常工作且分选准确
    4. 安装所需的收集装置并设置侧流
    5. 查看仪器的激光器和检测器配置，以确定可使用的荧光标记（我们的 BD FACS Aria 配备三根激光器，最多可检测九种颜色）
    6. 确定细胞分选仪上将使用的荧光标记后，即可进行补偿（如下所述）
12. 使用阴性对照样本和单阳性对照进行补偿。补偿是必要的，用于消除两个检测器之间的光谱重叠。需注意的是，补偿并非完全可靠，其效果会受到某些标记物染色亮度以及低自发荧光细胞荧光强度的影响，可能导致弱阳性与阴性群体之间分辨率不佳。
    为获得最佳结果，实验设计应将高亮度荧光染料用于表达水平较低或染色模式未知的标记物；而对于在细胞群体间具有良好分离度且高表达的标记物，应使用由红色或紫色激光激发的二聚体荧光染料。
    1. 可使用补偿微珠进行补偿，这些微珠为聚苯乙烯微粒，偶联了特异性识别小鼠、大鼠或大鼠/仓鼠 Ig 轻链（Kappa）的抗体。微珠易于染色，信号强，可方便地制备与实验样本相同荧光素的单染对照
    2. 建立一个模板，包含一个双变量图以显示前向散射光（FSC）与侧向散射光（SSC），以及每个将使用的荧光染料对应的直方图
    3. 运行阴性对照管，调节前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC），使目标细胞群体位于量程范围内
    4. 调节荧光 PMT 设置，使阴性群体或自发荧光位于直方图最左侧区域
    5. 记录阴性对照管的数据
    6. 运行单阳性对照管，并记录每管数据
    7. 在直方图上阳性部分绘制区间门，另在阴性部分绘制另一区间门
    8. 手动补偿通过调节阳性群体的中位数（在对数尺度上，中位数比均值更能准确反映集中趋势），使其等于阴性群体的中位数。实验中使用的每种荧光标记均需进行此操作
    9. 为调节中位数，需升高或降低光谱重叠值，直至各荧光参数的中位数尽可能接近
    10. 也可使用分析软件自动进行补偿。自动补偿利用补偿对照的记录数据，计算实验中所有荧光染料的代数矩阵，并用这些值减去非主色渗入主色检测器的信号贡献
13. 记录待分选的实验样本，并使用设门工具和子集分析方法定义目标细胞群体。
    1. 建立实验模板，包含一个显示 FSC 与 SSC 的散点图，并使用设门工具（多边形、矩形、区间或象限）圈定目标细胞群体。散点图反映细胞的物理特性，不同细胞类型具有不同的散射特征
    2. 确定荧光设门策略的最佳方法是使用“减去一荧光”（FMO）对照。FMO 对照管中包含实验所用的所有试剂，唯独缺少目标试剂。FMO 有助于区分弱阳性染色群体与宽泛的阴性群体
    3. 利用 FMO 管记录的数据，确定实验管中设门的位置
14. 确定设门后，可选择这些门进行分选至外部收集管中。根据仪器配置，一次最多可同时分选四个门（或细胞群体）
15. 在 4 °C 下运行实验样本管，开启偏转板，开始分选。可将 5 × 10⁵ – 1.5 × 10⁶ 个细胞分选至 12 × 75 mm 管中，或将 1.5 × 10⁶ – 4.5 × 10⁶ 个细胞分选至 15 ml 锥形管中
16. 获得所需数量的细胞后，手动停止分选
17. 进行分选后分析，以确定分选细胞群体的纯度

代表性结果

我们在此展示了小鼠脾脏 B 细胞和 CD4 T 细胞分选的结果（图 1）。脾细胞经 PE Texas Red 标记的抗小鼠 B220 抗体和 FITC 标记的抗小鼠 TCR 抗体染色β 以及Alexa Fluor 700标记的抗小鼠CD4抗体以鉴定B细胞（B220+TCRβ-) 和 CD4 T 细胞（CD4+TCRβ+）。分选使用 BD FACS Aria 仪器进行。分选后 B 细胞纯度为 >97%，且CD4 T细胞纯度为 >98%.

图1. FACS 分选后脾脏 B 细胞和 CD4 T 细胞的纯度。 小鼠脾细胞使用抗小鼠 B220、TCRβ 和 CD4 抗体进行染色。B 细胞的 FACS 分选通过 BD FACS Aria 仪器，圈选 B220+TCRβ- 细胞进行（图1A，左图，右下象限）。分选后进行分析以确定 B 细胞的纯度（图1A，右图）。x 轴显示 B220 染色，y 轴显示 TCRβ 染色。CD4 T 细胞的 FACS 分选使用相同的流式细胞仪，圈选 TCRβ+CD4+ 细胞进行（图1B，左图，右上象限）。分选后进行分析以确定 CD4 T 细胞的纯度（图1B，右图）。x 轴显示 TCRβ 染色，y 轴显示 CD4 染色。各象限中的阳性细胞百分比均已标出。

讨论

FACS 是一种高度精密的技术，用于纯化目标细胞群体，可获得极高纯度（95–100%）的分选细胞。因此，该技术在需要高纯度细胞的实验中尤为重要（例如微阵列分析）。当需要根据表面标志物的弱表达水平来纯化细胞群体，或需要分离表达同一表面标志物但表达水平不同的两种或多种细胞群体时，FACS 相较于其他可用的纯化方法具有显著优势。例如，根据 CD21 和 CD23 的表达水平差异，分离边缘区 B 细胞（B220⁺CD21^hiCD23^int/low）和滤泡性 B 细胞（B220⁺CD21^int/lowCD23^hi）。FACS 的另一个日益广泛的应用是单细胞分选，可用于对单个细胞进行分析（3, 4）。FACS 还常用于分选表达遗传编码荧光蛋白的细胞，例如绿色荧光蛋白标记的蛋白（5）。若进行无菌分选，则分选后的细胞可用于培养。然而，细胞活力和得率在分选过程中可能受到影响。通过采用适合细胞类型的最适分选温度，并在收集管装满后立即进行处理，可提高细胞活力。通过使用聚丙烯收集管、将分选细胞收集于富含血清的培养基中、间歇性翻转收集管、将收集管维持在最适温度，以及对分选细胞以约 10 分钟的离心时间进行离心，可提高细胞回收率（http://cyto.mednet.ucla.edu/Protocol.htm）。

超高速分选仪的发展拓展了流式分选在临床环境中的应用可能性。FACS 的潜在临床应用包括从人血中纯化血液干细胞用于治疗目的、癌症治疗中的应用、羊膜穿刺术的替代、人类精子的分选以及早期疾病检测（6, 7）。

对于多色染色，抗体选择是一个关键步骤，荧光染料的选择需根据每种特定仪器的检测系统而定。多家公司生产细胞分选仪，其激光配置根据用户需求而有所不同。因此，在未确认兼容性的情况下，不能直接使用已发表研究中所用的完全相同的抗体。为了优化抗体选择，应考虑所检测蛋白的表达水平。通常，应使用亮度最高的荧光染料标记抗体来染色低表达的表面标志物，而高表达的表面标志物则可使用较暗的荧光染料进行染色（8）。此外，应尽可能选择其发射光谱重叠最小的抗体。在多色染色中，几乎很难选择完全无光谱重叠的荧光染料，此时需要进行补偿校正。

补偿是必要的数学方法，用于消除不同荧光染料发射光谱之间可被检测器检测到的荧光重叠。换句话说，需将一种荧光染料产生的重叠荧光信号从另一种荧光染料的发射光谱中扣除。补偿计算需要未染色对照以及每种用于多色染色的荧光染料各自的单阳性对照（9, 10）。补偿可通过细胞或微珠进行。微珠易于染色，信号强，并可简便地制备与实验样本含有相同荧光素的单染对照。当目标细胞表面蛋白表达水平较低，或初始细胞群体中目标细胞数量有限时，使用补偿微珠尤为有利。

选定抗体后，应通过滴定分析优化其活性。如果流式细胞仪配备高功率激光器，这一步骤尤为重要。使用非最佳浓度的染色抗体可能导致目标细胞群与总细胞群之间分离效果不佳。抗体浓度过高会增加非特异性抗原染色的风险。因此，抗体滴定可帮助选择出既能使阳性细胞群获得最大荧光强度，又能将背景染色降至最低的抗体浓度（8）。

荧光激活细胞分选（FACS）现已成为分离细胞亚群的标准技术。只要能够制备单细胞悬液，并有相应的抗体可用于鉴定目标细胞群体，该技术便可用于分离任何类型的细胞。当需要获得高纯度细胞群体时，FACS 是首选方法。