SC1通过同时抑制Ras-GAP和ERK1发挥作用。我们在无LIF条件下测试了SC1在维持小鼠胚胎干细胞自我更新中的功能，结果表明SC1能够维持小鼠胚胎干细胞培养的自我更新能力。
本文内容
摘要
摘要
小鼠胚胎干细胞（ES细胞）通常在白血病抑制因子（LIF）存在下进行培养，以维持其自我更新能力。1然而，LIF 价格昂贵，且 LIF/JAK/STAT3 通路的激活并非维持自我更新状态所绝对必需的。2SC1 小分子可能是 LIF 的一种经济替代物。SC1 通过同时抑制 Ras-GAP 和 ERK1 发挥作用。3其作用机制的图示使其成为研究自我更新基本分子机制的有用工具。在此，我们演示了在 SC1 存在下培养小鼠胚胎干细胞（ES 细胞）的步骤，并证明这些细胞能够在无白血病抑制因子（LIF）的条件下维持自我更新能力。在 SC1 培养条件下的细胞表现出与 LIF 维持培养的细胞相似的形态。经过五次传代后，两种条件下的细胞均呈现典型的小鼠 ES 细胞形态。在 SC1 存在下经过五次传代后，仍可观察到典型多能性标志物（Oct4、Sox2、Nanog 和 SSEA1）的表达。此外，SC1 对小鼠 ES 细胞未引起明显毒性。
方案
1. MEF饲养层平板的制备
- 在培养胚胎干细胞前一天，解冻一管经照射处理的E14.5天CF-1小鼠胚胎成纤维（MEF）饲养层细胞（参见我们关于如何解冻胚胎干细胞的操作步骤）。
- 将MEF饲养层细胞以每孔10,000个细胞的密度接种于12孔板中。于37°C、5% CO2条件下培养过夜。MEF细胞培养基：DMEM添加10% ES-PBS、1X谷氨酰胺和1X非必需氨基酸。
2. 小鼠胚胎干细胞自我更新的维持
- 使用胰蛋白酶消化分离ES细胞。将细胞以50,000个细胞/孔的密度接种至预先制备好的MEF饲养层培养板中，培养基为生长培养基（ Knockout MEM 添加15% KSR、4 mM L-谷氨酰胺、0.1 mM 非必需氨基酸和1X BME），并加入所需浓度的SC1（我们使用了100 nM、300 nM和1 μM）。另设一阳性对照孔，添加1000 μ/ml LIF。将细胞置于37°C、5% CO2条件下培养过夜。
- 在每次传代中，于37°C、5% CO2条件下培养细胞3-4天，每48小时更换一次培养基。
- 使用胰蛋白酶以1:10至1:15的比例传代细胞，以维持与初始接种密度相近的细胞密度。经过5次传代后，可通过免疫细胞化学方法检测细胞典型多能性标志物的表达情况。
3. 多能性标志物的免疫细胞化学检测
- 用 PBS 轻柔洗涤细胞三次。
- 加入 500 μl 固定液，在室温下固定细胞 20 分钟。
- 用 PBS 轻柔洗涤细胞三次。
- 加入 500 μl 封闭缓冲液，在室温下封闭非特异性结合位点 1 小时。
- 加入 250 μl 特异性一抗（我们使用 Nanog、Sox2、SSEA1 和 Oct4，稀释比例分别为 1:500、1:2000、1:500 和 1:500），孵育细胞。
- 用 PBS 轻柔洗涤细胞三次。
- 加入 250 μl 二抗，在室温下避光孵育 2 小时（我们使用 Alexa Fluor® 555 标记的驴抗小鼠 IgG，稀释比例为 1:2000；以及 Alexa Fluor® 488 标记的驴抗兔 IgG，稀释比例为 1:2000）。
- 用 PBS 轻柔洗涤细胞三次。
- 在最后一次洗涤中加入 DAPI（终浓度为 1 μg/ml），孵育 5 分钟以显示细胞核。
- 在荧光显微镜下观察细胞。
4. 代表性结果：
1. 形态学结果：
小鼠 ES 细胞（ESC R1）在 MEF 饲养层细胞上培养，添加 LIF 或 SC1 以维持其未分化状态下的自我更新。第二次传代后，未添加 LIF 或 SC1 的细胞（阴性对照）中可观察到分化现象；经过 5 次传代后，几乎观察不到未分化的克隆。经 LIF 处理的克隆（阳性对照）在整个 5 次传代过程中均保持未分化状态。经 300 nM 或 100 nM SC1 处理的细胞在 5 次传代后也保持未分化状态，但经 1 μM SC1 处理的细胞在第四次传代后出现细胞死亡。（应用说明图 2）表 1 总结了形态学观察结果。
2. 多能性标志物的表达
经过5代培养的小鼠ES细胞经固定后，通过免疫细胞化学检测SSEA1、Oct4、Nanog和Sox2的表达。其标志物表达情况与在LIF中维持的细胞相似。（应用说明中的图3和图4）
图1：在LIF或SC1中维持培养的细胞形态学比较。未观察到形态学上的差异。
图2和图3：在SC1或LIF条件下维持的胚胎干细胞中Nanog、SSEA1、Sox2和Oct4的染色结果（应用说明图4）。在SC1中维持的细胞与在LIF中维持的细胞显示出相似的多能性标志物表达水平。
表1
| 阴性对照 | LIF 阳性对照 | SC1 1 µM | SC1 300 nM | SC1 100 nM | |
| 第1代 | 正常的胚胎干细胞形态 | 正常的胚胎干细胞形态 | 正常的胚胎干细胞形态 | 正常的胚胎干细胞形态 | 正常的胚胎干细胞形态 |
| 第2代 | 部分细胞呈现分化形态 | 正常的胚胎干细胞形态 | 正常的胚胎干细胞形态 | 正常的胚胎干细胞形态 | 正常的胚胎干细胞形态 |
| 第3代 | 大多数细胞已分化 | 正常的胚胎干细胞形态 | 正常的胚胎干细胞形态 | 正常的胚胎干细胞形态 | 正常的胚胎干细胞形态 |
| 第4代 | 无胚胎干细胞克隆形成 | 正常的胚胎干细胞形态 | 观察到细胞死亡 | 正常的胚胎干细胞形态 | 正常的胚胎干细胞形态 |
| 第5代 | 已分化 | 正常的胚胎干细胞形态 | 观察到细胞死亡 | 正常的胚胎干细胞形态 | 正常的胚胎干细胞形态 |
讨论
小分子SC1可用于维持小鼠胚胎干细胞的自我更新并保持其未分化状态。然而，在未经过测试的细胞系上使用之前，应进行滴定以确定其最佳浓度。例如，我们在小鼠胚胎干细胞系ESC R1上测试了三种浓度：100 nM和300 nM的浓度能够维持小鼠胚胎干细胞的生长，但1 μM的浓度具有毒性。
SC1也可在无饲养层条件下使用。
披露
本文作者受雇于Stemgent公司，该公司生产本文所使用的试剂和仪器。
致谢
作者谨感谢斯克里普斯研究所的 Sheng Ding 博士和北京大学的 Hongkui Deng 博士提供的帮助与指导。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| SC1 | Stemgent | 04-0011 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| SSEA-1 抗体 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | 21702 | |
| Nanog 抗体 | Abcam | ab21603 | |
| Sox2 抗体 | Chemicon International | Ab5603 | |
| Oct4 抗体 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-5279 |
参考文献
- Williams, R. L., Hilton, D. J., Pease, S., Willson, T. A., Stewart, C. L., Gearing, D. P., Wagner, E. F., Metcalf, D., Nicola, N. A., Gough, N. M. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
- Ying, Q. L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P., Smith, A. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453, 519-523 (2008).
- Chen, S., Do, J. T., Zhang, Q., Yao, S., Yan, F., Peters, E. C., Scholer, H. R., Schultz, P. G., Ding, S. Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule. Proc. Natl. Acat. Sci. USA. 103, 17266-17271 (2006).
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