斑马鱼的上颌须是一种皮肤感觉器官，包含外胚层、中胚层和神经嵴来源的组织。重要的是，成体上颌须在近端截除后能够再生。本视频介绍了上颌须的发育过程，并演示了一种诱导其再生的手术方案，随后展示了上颌须样本的采集、包埋及后续成像操作。
本文内容
摘要
摘要
触须是鱼类、爬行动物和两栖动物中存在的皮肤感觉附属物。斑马鱼（Danio rerio）会发育出两对触须——一对较短的鼻须和一对较长的上颌须。上颌须组织包含来自外胚层、中胚层和神经嵴的细胞，包括皮肤细胞、腺体、味蕾、黑色素细胞、循环血管和感觉神经。与大多数成体组织不同，斑马鱼的上颌须具有光学透明性，使我们能够观察这些组织类型在整个生命周期中的发育与维持过程。
本视频展示了上颌须的早期发育过程（始于受精后约一个月），并演示了在成体附属器官中诱导再生的手术方案（>受精后3个月以上）。简要而言，使用无菌镊子夹住麻醉鱼左侧上颌须，在上颌骨尾侧边缘稍远端处将其提起。将一把精细的无菌弹簧剪刀紧贴镊子在此位置剪断上颌须的主干，以此确定截除平面的解剖学标志。再生生长可相对于此平面进行测量，并与对侧上颌须进行比较。上颌须组织再生迅速，损伤后2周内即可达到最大再生程度。
分析再生触须的技术包括将成对的触须（再生触须与对照触须）解剖后嵌入标准DNA电泳凝胶的孔中。嵌入的样本可在体视显微镜下方便地拍摄，用于观察大体形态和形态测量学特征，并可在进行石蜡组织学、冷冻切片和/或整体免疫组织化学等后续实验前保存数周。这些方法确立了上颌触须作为一种新型的in vivo组织系统，可用于在斑马鱼的遗传背景下研究多种细胞类型的再生能力。
方案
斑马鱼养殖
斑马鱼的饲养和培育遵循标准方法1。在晚期幼体阶段之后，斑马鱼的发育阶段可通过其标准体长（SL）来衡量，即从上唇最前端至尾鳍基部（最末端的尾下骨板）之间的直线距离（单位为毫米）2。大约在受精后一个月（标准体长10–12 mm），鼻须和上颌须分别作为透明的上皮芽出现在嗅窝附近以及上颌骨的后角处。随着斑马鱼的成熟，这些触须逐渐伸长为细窄、类似胡须的附属结构。由于上颌须较大（2–3 mm）且更易于操作，本实验方案仅针对这一特定附属结构；然而，类似的技术也可经调整后应用于较小的鼻须。
鲤科鱼类须部剪切
- 在所需阶段麻醉成年斑马鱼（例如将受精后约3-6个月、体长1.5-2.5 cm的幼鱼浸入用系统水配制并用缓冲液调节至pH 7.0的0.015% MS-222（氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐）溶液中进行麻醉。观察至鱼体游动停止，鳃盖呼吸变得缓慢且规律。根据鱼体大小，完全麻醉通常需要约2-5分钟。
- 使用水族箱鱼网，每次将1-3条鱼转移至培养皿中折叠的湿润纸巾上。用钝头刮勺调整鱼体方向，使其彼此平行且左侧卧位朝上。将湿润纸巾的一部分折叠覆盖在鱼体尾部，包裹整个身体直至鳃盖（鳃部），以保持皮肤和鳃在操作过程中的湿润。
- 在体视显微镜下观察培养皿，采用低角度入射光照射头部区域。聚焦于左上颌须的基部，该部位从上颌骨后腹侧角伸出（图1）。
图1. - 紧握触须的柄部，位置略靠近上颌边缘的远端。抬起触须柄部，将尖头弹簧剪刀的刀口置于镊子夹持处稍近端的位置，可将剪刀轻触镊子以保持稳定。沿触须柄部滑动剪刀刀口，直至切割边缘接近上颌边缘。闭合剪刀，切断触须柄部。被截下的触须仍由镊子夹持，可取下用于固定或进一步观察。
- 立即将鱼转移到含有少量清洁系统水（约500 mL）的小型水族箱中，并加入一滴亚甲蓝，以控制表面真菌感染。让鱼过夜恢复。次日早晨，将鱼重新放回养殖系统。触须再生在2周后达到最大。
匹配触须对的琼脂包埋
- 采用适当的安乐死方法收集鱼类，并置于含4%多聚甲醛-磷酸盐缓冲液（PBS）的50 mL离心管中，于摇床上固定 4°C 过夜。固定液体积应至少为组织体积的十倍。固定后，将多聚甲醛废液弃置到经批准的容器中，并用 PBS 多次更换彻底冲洗组织。
- 在250 mL玻璃烧瓶中配制150 mL 2%琼脂糖（Tm ~37°C) 溶于蒸馏水中。使用微波炉或电热板加热，期间定期搅动，直至完全溶解。将熔融溶液在50-60°C 水浴锅
- 组装标准的凝胶电泳装置，将一个带垫圈的小型凝胶模具（10 × 10 cm；凝胶体积约100 mL）紧贴缓冲液室的两侧固定。插入2至4个细齿加样梳（4 × 1.5 mm）。
- 在水平表面上，将融化的琼脂糖倒入模具中，使其刚好覆盖梳子的底部，形成非常浅的加样孔。立即将剩余的琼脂糖放回温水浴中，后续将用于组织包埋（步骤9-12）。将一根长玻璃巴斯德吸管放入烧瓶中，使吸管与琼脂糖保持相同温度。
- 让凝胶硬化20-30分钟。取出梳子，然后将含有硬化凝胶的凝胶模具从缓冲液槽中取出。用实验室胶带将凝胶模具的开口两侧牢固封住，防止凝胶滑出。胶带应覆盖在琼脂糖表面几毫米，以便后续添加更多琼脂糖（步骤13）。
- 将凝胶模具置于体视显微镜的载物台上。放大一个空的加样孔，调节焦距使孔边缘清晰。
- 在靠近小孔的琼脂糖表面，用移液器滴加一滴含有固定胡须标本的水或缓冲液例如， 再生和对照）。使用弯曲的昆虫针将湿润的样本拖入孔中，并推至孔底。将须条的轴平行排列，并分别紧贴孔的两条长边对齐。表面张力有助于固定组织的位置。
- 准备包埋时，使用细尖的移液器吸头或实验纸巾的一角除去孔中的多余液体。操作应迅速，以避免组织干燥。
- 使用预热的玻璃巴斯德吸管，将新鲜熔化的琼脂糖轻柔地滴加到样品周围及内部，以固定须组织。切勿过度填充。在琼脂糖凝固前，用昆虫针进行最后的微调。
- 在孔旁放置一张编号的纸质标本标签，并用少量琼脂糖固定。
- 对每个样本孔重复步骤6至10。
- 如需进行图像校准，可插入一张印有微米刻度尺的纸张（例如， http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/) 放入空孔底部。将滤纸压平至孔底，并用温热的琼脂糖覆盖。
- 所有样本包埋完成后，凝胶表面会不平整，带有凝固的琼脂糖液滴。将凝胶置于平坦表面上，轻轻倒入额外熔化的琼脂糖，直至上表面均匀。使用尽可能少的琼脂糖以获得光滑表面；过多的琼脂糖会影响透射光摄影效果。让此顶层凝固。
- 现在可将凝胶置于体视显微镜载物台上拍照，以记录每对须的粗略形态。通过拍摄嵌入的微米尺刻度获取图像校准。
- 整个凝胶可用湿润的纸巾包裹后密封于塑料袋中保存于 4° 数周。
- 为进一步分析，可用解剖刀或剃须刀片从凝胶中切下含有成对触须的琼脂块，并按照标准方法进行石蜡组织学处理或冷冻切片。3,4. 或者，可使用细针将单个触须从琼脂糖中解剖出来，用水冲洗，然后进行其他下游应用（例如， 整体免疫组织化学或共聚焦显微镜观察
讨论
斑马鱼上颌触须是一个尚未被充分利用的组织系统，可用于研究斑马鱼中多种细胞类型的生长、维持和再生。尽管触须附属物在人类中没有对应结构，但它所含的细胞类型高度保守，使得研究人员能够在一种光学透明且解剖结构简单的圆柱形组织中研究皮肤、腺体、黑色素细胞、循环血管和神经。与已被广泛研究的尾鳍类似，触须组织可通过截断手术诱导其再生。利用上颌边缘作为解剖学标志，可以精确定位截断平面，从而便于测量触须的再生生长情况。对于经验丰富的操作者而言，每台手术仅需数秒钟。鱼类恢复迅速，迄今为止我们未观察到该手术对鱼类行为产生任何短期或长期影响。单侧上颌触须缺失的斑马鱼在游泳、进食和繁殖能力方面均与未接受手术的对照组相当，并且在术后长达6个月的组织采集时间内具有相似的存活率。预计该手术的生理影响极小，原因如下：1）触须所携带的口外味蕾在鱼体上皮的许多其他部位也存在，包括嘴唇、脸颊和头部5；2）再生触须在截断后72小时内即可出现新分化的味蕾（LeClair et al., 未发表数据）。因此，上颌触须成为一个理想的微创系统，可用于在成年脊椎动物体内研究伤口愈合、血管再生和神经再支配过程。
手术诱导再生后，可在不同时间点采集须状突起，用于形态测量学分析和/或固定组织的显微分析。值得注意的是，上颌须的长度（2–3 mm）和直径（100–200 mm）与斑马鱼胚胎相近，便于应用多种标准实验方案，包括石蜡切片组织学、冷冻切片、整体免疫组织化学以及原位杂交。综上所述，这些特点使上颌须成为研究组织修复与再生的一个高度可行的体内模型。
致谢
这些方法由 E.E.L. 在 J.T. 实验室进行研究休假期间开发。德保罗大学研究委员会以及美国国立卫生研究院/国家牙科与颅面研究所 R01 基金（项目编号：DE016678）为本研究提供了资助。我们衷心感谢 CMRC 斑马鱼核心设施的动物护理技术员 Caroline Hunter 以及我们的本科实验室助手 Paulina Pawluczuk 所付出的努力。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 进行触须剪切和琼脂包埋需要配备透射和入射光纤照明的立体解剖显微镜 | |||
| 鱼类系统用水 | |||
| 2 个斑马鱼交配缸 | |||
| MS-222（氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐；Sigma Chemical #E10521-10G） | |||
| 无菌 120 mm 培养皿 | |||
| 湿润的纸巾 | |||
| 钝头金属刮刀 | |||
| Dumont #55 Bio Inox 镊子（Fine Science Tools #11255-20） | |||
| Mini-Vannas 弹簧剪刀（Fine Science Tools #15000-00） | |||
| 亚甲蓝抗真菌剂（Drs. Foster & Smith #CD-905781） | |||
| 小型水族网 | |||
| 4% 多聚甲醛溶于 1× 磷酸盐缓冲液（PF-PBS），分装至 50 mL 锥形管中，于 -20°C 冻存备用 | |||
| 1× 磷酸盐缓冲液（pH 7.27–6） | |||
| 250 mL 玻璃烧瓶 | |||
| 2% 琼脂糖溶于蒸馏水中 | |||
| 标准小型琼脂糖凝胶电泳装置（凝胶尺寸约为 10 cm 见方） | |||
| 细齿电泳加样梳（梳齿尺寸 4 × 1.5 mm） | |||
| 温水浴（50–60°C） | |||
| 实验室封口胶带 | |||
| 黑色搪瓷昆虫针，000 号（Fine Science Tools #26000-25） | |||
| 1–2 个针持（Fine Science Tools #26016-12） | |||
| 9 英寸玻璃巴斯德吸管 | |||
| 吸管球或泵 | |||
| 实验室用纸巾 | |||
| 小型纸质标签 | |||
| （可选）打印的校准标尺 | |||
| 湿润的纸巾 | |||
| 带密封条的塑料自封袋 | |||
| 手术刀/剃须刀片（用于切割琼脂块） |
参考文献
- Westerfield, M. Chapter 1 General Methods for Zebrafish Care. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed., Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Howe, J. C. Standard length: Not quite so standard. Fisheries Research (Amsterdam). 56, 1-7 (2002).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin Embedding Tissue Samples for Sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 6, (2008).
- Westerfield, M. Ch 8.3 Agar Embedding for Cryostat Sectioning of Embryos or Larvae. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed., Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Hansen, A., Reutter, K., Zeiske, E. Taste bud development in the zebrafish, Danio rerio. Dev Dyn. 223, 483-496 (2002).
重印与许可
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