一种可同时原位可视化病毒特异性CD8+ T细胞与病毒感染细胞的技术 In situ

摘要

一种结合原位四聚体染色与原位杂交（ISTH）的技术，能够实现病毒特异性CD8+ T细胞与其病毒感染靶细胞之间空间邻近性的可视化、定位和分析，并确定这些免疫效应细胞与靶细胞之间的数量关系及其对感染结局的影响。

摘要

病毒特异性CD8+ T细胞的数量及其相对于被感染靶细胞数量和位置的分布，被认为在决定感染结局（从清除到慢性持续性感染）方面至关重要。本文介绍了一种评估免疫效应细胞（E）即病毒特异性CD8+ T细胞与感染靶标（T）之间空间关系和定量关系的方法，该方法结合原位四聚体（IST）染色以检测病毒特异性CD8+ T细胞，以及原位杂交（ISH）技术以检测发生免疫防御与感染交战的组织中的病毒RNA阳性细胞。IST染色与ISH的联用简称为ISTH，可实现免疫效应细胞与靶细胞位置的可视化与定位绘图，并便于确定E:T比值。这些参数继而可用于分析空间邻近性与免疫应答的时机及强度之间的关系，从而预测早期感染的结局。

方案

该方法已用于李 et al., Science 323, 1726-1729 (2009) 报道的研究中，详见 Li et al., Science 323, 1726-1729 (2009)。

原位四聚体染色与原位杂交（ISTH）联合实验方法

ISTH 实验流程可分为四个步骤：1）对组织中抗原特异性的 CD8+ T 细胞进行 IST 染色；2）通过原位杂交（ISH）检测病毒感染的 RNA+ 细胞；3）对 IST 染色的细胞和病毒 RNA+ 细胞进行共聚焦显微镜成像；4）图像分析，包括图像拼接图的构建以及四聚体阳性细胞和病毒 RNA 阳性细胞的定位图谱绘制。

1. 组织切片中抗原特异性CD8+ T细胞的IST染色。

1. 使用振动切片机或手术刀将新鲜组织切成200 μm厚的切片。
2. 将振动切片机浴槽用无菌 PBS-H 预冷，并冷却至 0–2 ℃° C. 将振动切片机刀片角度设置为较陡的27°尽可能将组织置于冰上保持低温，以最大限度减少降解。冷藏后的组织在使用振动切片机进行切片时也更易于操作。
3. 用手术剪刀或解剖刀将组织切成约0.5 cm宽、0.25 cm高的小块。将组织块放入称量舟或小培养皿中，并用约40°将4% PBS缓冲的低熔点琼脂糖在融化后冷却至适宜温度。确保组织与培养皿底部充分接触，若组织漂浮则将其轻轻压下。置于冰上凝固，通常需要3-5分钟。
4. 用Loctite胶将振动切片机组织块进行包被。用解剖刀切除组织周围的琼脂糖，然后用镊子小心地将包裹在琼脂糖中的脆弱组织转移至涂有胶的振动切片机组织块上。组织一旦放置在组织块上后，不得再移动。置于冰上干燥约10分钟。
5. 将组织块固定于振动切片机上，使用极慢的前进速度和相对较高的振幅，切成200 μm厚的切片。速度和振幅设置因不同振动切片机而异。若无振动切片机，或组织不适合振动切片，则使用手术刀将组织切成薄条。
6. 用毛笔将切片转移至含有1 ml预冷PBS-H的24孔细胞培养板孔中的组织切片架内，每孔切片架中放置不超过四片组织切片。用记号笔在细胞培养板盖上标注实验样本信息，并用橡皮筋将盖子固定于板上。
7. 对于使用振动切片机切割效果不佳的组织（如肠道），可改用手术刀或剃须刀片尽可能切成薄条。使用手术刀切割的组织条，每个孔中仅放置一片。
8. 切完组织后立即进行染色。在固定前始终将切片置于低温环境中，以最大限度减少降解，并避免切片干燥。将切片保存在预冷的无菌 PBS-H 中。
9. 在4°C下，将组织切片与0.5 mg/ml的FITC偶联四聚体溶液在避光条件下孵育过夜。此孵育步骤中可同时加入针对细胞外表位的小鼠或非兔源抗体，例如抗-CD8抗体，按1:200比例用封闭液稀释。本步骤及后续所有孵育步骤均使用1 ml溶液/孔，并在4°C下进行。°将培养板置于摇床上。不同实验样本的组织腔室之间至少间隔一个空孔，以防止后续步骤中溶液交叉污染。
10. 一抗孵育后，用预冷的PBS-H溶液洗涤切片两次，每次20分钟。操作时将组织腔室转移至另一含有预冷PBS-H的24孔细胞培养板中。移动组织腔室时，注意避免一个实验样本的液体滴入另一个样本中。后续所有孵育和洗涤步骤均需类似地将组织腔室转移至盛有相应溶液的新鲜培养板中。操作过程中应持续观察组织腔室中的切片，确保切片未黏附于腔室侧壁。
11. 用新鲜的PBS缓冲的4%多聚甲醛在室温下固定切片2小时。用冷的PBS-H洗涤2次，每次5分钟。
12. 用兔抗FITC抗体（例如Biodesign，1:10,000）在封闭液中孵育一至三天。如需共标记，可在此次孵育中同时加入针对细胞内表位的非兔来源抗体。若选择此方案，需在第二次孵育前根据需要暴露表位，并对细胞进行通透和封闭处理。
13. 若使用针对需要从甲醛固定中进行抗原修复的胞内表位的抗体，可在微波炉中将样本置于0.01 M尿素溶液中煮沸3次，每次10秒，每次加热间隔2分钟。需格外小心，因沸腾溶液可能导致组织切片被冲出孔外。若发生此情况，可用画笔将切片从组织腔侧壁或培养板盖上轻轻推回至相应组织腔底部。若抗体无需抗原修复，则省略此步骤。
14. 若使用靶向细胞内表位的抗体，在第二次孵育前，用含0.3% Triton X-100和2%正常山羊血清的PBS-H对组织切片中的细胞进行透化和封闭处理，持续一小时。随后在含0.3% Triton X-100和2%正常山羊血清的PBS-H中进行后续抗体孵育步骤。
15. 第二次孵育后，用 PBS-H 洗涤切片 20 分钟至数小时，重复两次，共洗涤三次。随后进行最终孵育，使用适当荧光标记的二抗，例如将 Cy3 标记的山羊抗兔 IgG 和 Alexa 488 标记的山羊抗小鼠 IgG 各自按 1:1000 比例溶于封闭液中。孵育时间为 1 至 3 天。孵育期间及之后应将培养板用锡箔纸包裹，避光保存，以防荧光分子发生光淬灭。
16. 用 PBS-H 洗涤切片 20 分钟至数小时，重复两次，共洗涤三次。
17. 对于结合原位杂交的原位四聚体染色，将切片在4%多聚甲醛中后固定1小时，以固定四聚体和抗体的位置，然后再次用PBS-H冲洗切片并封片。
18. 使用画笔将切片转移至显微镜载玻片上。每张切片用含4mg/ml对羟基苯丙酸丙酯或其他含荧光保护剂的封片剂（如甘油/明胶）覆盖，并加盖盖玻片。将载玻片置于避光的玻片盒中，于-20℃保存。°用酒精清洗培养板并去除盖子上的标签。培养板可重复使用。
19. 使用共聚焦显微镜分析染色的组织切片，然后可继续进行原位杂交（ISH）。

2. 通过原位杂交检测病毒RNA阳性感染细胞。

该原位杂交方案根据我们先前发表的方案^4,5进行了如下修改：

1. 从较厚的原位四聚体染色切片中重新切下5-8微米厚的切片。
   1. 200 微米厚的切片在 70 ℃ 下加热°在 5 分钟内升温至 C 以使组织切片从载玻片上脱落。
   2. 然后将切片置于干冰上用OCT包埋。
   3. 使用冷冻切片机从厚切片中切下8微米的切片，并将其贴附于硅烷化载玻片上。
   4. 载玻片可保存于 -80°在密封盒中于 C 条件下进行后续原位杂交。
2. 原位杂交
   1. 将切片依次浸入90%乙醇和DEPC处理水中，每步3分钟，以重新水化组织切片。
   2. 在98℃下，使用10 mM柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）加热处理组织切片以进行通透化°在水浴中 37 °C 孵育 15 分钟。
   3. 室温下冷却组织切片 20–30 分钟。
   4. 用经DEPC处理的水洗涤两次，每次3分钟。
   5. 将切片浸入含0.25%乙酸酐的0.1 M TEA（三乙醇胺，pH 8.0）溶液中，孵育10分钟以乙酰化组织切片。
   6. 将载玻片转移至 0.1 M TEA（pH 8.0）中，孵育 5 分钟。
   7. 将切片与探针杂交 ³⁵S标记的病毒特异性（如HIV-1、SIV）反义探针或正义探针（HIV-1、SIV的阴性对照） ³⁵S标记的LCMV核糖探针（正义与反义链混合）
   8. 在42℃过夜杂交后，用2xSSC洗涤切片两次，每次5分钟°C.
   9. 用STE溶液（0.5 M NaCl，1 mM EDTA，20 mM Tris-HCl，pH 7.5）洗涤切片5分钟。
   10. 在37℃下用RNase A和T1在STE中消化切片°30 分钟，C
   11. 用含50%甲酰胺的2x SSC缓冲液清洗切片5分钟。
   12. 用1x SSC缓冲液清洗切片10分钟。
   13. 用 0.5 x SSC 溶液清洗切片 15 分钟。
   14. 在含有0.3 M醋酸铵的70%、80%和100%乙醇中依次脱水，每次5分钟。
   15. 用核径迹乳胶覆盖切片
   16. 在暗室中干燥1小时。
   17. 4℃下孵育切片°C，SIV 感染 11 天，LCMV 感染 3 天。
   18. 在 D19（Kodak，货号# 146 4593）中显影 3 分钟，用 dH₂O 漂洗 30 秒，用快速定影液（Rapid Fixer，Kodak，货号# 146 4106）定影 4 分钟，再用 dH₂O 漂洗，每次 5 分钟，共 3 次。
   19. 依次在70%、80%和无水乙醇中脱水，每步5分钟。
   20. 使用与荧光兼容的Permount封片剂封片。

3. 获取共聚焦显微镜图像。

1. 使用 Bio-Rad MRC 1000 共聚焦显微镜，或其他配备 Epi2-Blue Reflection 装置的共聚焦显微镜，采集 ISTH 图像。
2. 使用 Epi1-605 检测红色四聚体荧光染料，Epi2-522 DF32 检测绿色 CD8 荧光染料，Epi2-Blue Reflection 检测银颗粒（放射自显影中显影的 ISH 信号），放大倍数为 20x（用于 SIV）或 60x（用于 LCMV）。
3. 在每个视野的三个通道中，以 1 微米为间隔连续采集 Z 轴序列图像。
4. 按从左到右、从上到下的顺序采集每张切片的图像，并根据其在 Excel 文件中的行和列命名每幅图像。
5. 每幅图像应与相邻图像保留约 20% 的重叠区域，以避免重建拼接图像时出现间隙。

4. 图像分析：拼接图像重建、细胞中心点计算与空间分析。

1. 使用共聚焦助手软件（Confocal Assistant，版本 4.02）将Z轴序列图像按每个通道投影为单幅图像。
2. 使用 Photoshop 7.0 的动作程序，自动将三个通道的投影图像合并为一幅 RGB 图像。
3. 在 Photoshop 7.0 中将合并后的图像按图层拼接，生成一幅拼合图像。
4. 通过 MetaMorph（版本 7.1.3）或作者提供的 Photoshop 程序，将单个银颗粒和四聚体染色信号与细胞对应，并标定 SIV RNA+ 细胞和四聚体+细胞中心（质心）的 X、Y 坐标。
5. 将质心数据以数字形式导出至 Excel 文件。通过 Excel 文件中切片内四聚体+细胞与病毒 RNA+ 细胞的总数计算 E:T 比值。

通过将红色四聚体阳性细胞和蓝色SIV RNA阳性细胞各自的图表从Excel文件中复制并粘贴到Photoshop文档中，可捕获二者之间的空间关系。将图层不透明度降低以对齐和缩放网格，使其重合后，选择蓝色RNA阳性细胞的位置并将其复制粘贴到新图层中，随后删除用于对齐网格的图层，最终在合并后的图像中显示出四聚体阳性细胞与病毒RNA阳性细胞的位置分布。

5. 附加说明

若切割感染性组织：

在生物安全二级增强型（BSL2.5）实验室中操作。使用剃刀刀片时需特别小心。使用镊子将刀片装入振动切片机的刀片架中。若无法用镊子安装刀片，则应在将组织放入浴槽前完成安装，且不得更换刀片。切片完成后，使用镊子取出刀片。在取出刀片前，先用70%乙醇或DMQ喷洒刀片进行消毒。与常规操作一致，刀片应丢弃至锐器容器中。每次接触组织或罐中受污染的PBS后，应更换外层手套或用消毒剂冲洗。操作结束后，若处理的是传染性材料，需向罐中的PBS加入DMQ消毒剂，并静置数分钟后再行移除。将已消毒的PBS排入下水道。随后用水冲洗罐体，以去除盐分和残留消毒剂。用DMQ清洁工作区和实验器具，再用水冲洗器具。

由生物素化MHC单体制造四聚体：

从贝克曼库尔特公司获取生物素化的MHC I类分子，例如使用Gag（SLYNTVATL）、Pol（ILKEPVHGV）或无关MART肽（ELAGIGILTV）制备的HLA-A *0201/B₂m/肽分子。在NIAID四聚体中心制备使用Gag（KIRLRPGGK）或Nef（QVPLRPMTYK）肽的生物素化HLA-A *0301/B₂m/肽分子。四聚体通过在8小时内分6次加入FITC标记的ExtraAvidin（Sigma）至生物素化的Mamu A*01/B₂m/肽单体中，最终达到4.5:1的摩尔比而生成。缓慢加入ExtraAvidin的原因在于反应早期单体过量，可确保所加入的每分子ExtraAvidin均能结合四个生物素位点。而在反应后期，由于剩余单体减少，该过程效率降低，ExtraAvidin未完全结合四个位点的可能性增加。若一次性加入全部ExtraAvidin，反应效率将降低，导致更多ExtraAvidin分子仅结合2个或3个单体。

讨论

由于本报告中使用病毒RNA作为病毒感染细胞的标志物，因此杂交前的所有试剂都应为无RNA酶的。此处描述的原位杂交步骤经过改良，以保留原位四聚体染色的荧光信号。由于原位杂交检测到的病毒感染细胞所产生的放射自显影信号位于约一个细胞直径的深度，因此用于原位四聚体染色的厚切片必须重新切割为5–8微米厚的切片。

本文所述的原位四聚体与原位杂交（ISTH）联用新技术，可实现对病毒特异性CD8+ T细胞与病毒感染靶细胞之间空间关系的同步可视化、定位及分析。该方法可用于评估基于CD8+ T细胞的疫苗，以及其他非病毒病原体与宿主相互作用的研究。本文描述的图像分析方法亦可调整用于研究任何两类在原位相互作用的细胞群体之间的空间关系，例如，我们近期在利用猕猴免疫缺陷病毒感染恒河猴的非人灵长类动物模型研究HIV-1性传播时，即应用了质心定位作图法⁶

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
溶液与试剂：
PBS-H 含肝素（100 μg/ml 或 18.7 U/ml）的磷酸盐缓冲液，用于抑制RNase 含肝素（100 μg/ml 或 18.7 U/ml）的 RPMI 组织培养基，用于抑制 RNase 活性 PBS 中的 4% 低熔点琼脂糖 含2%正常山羊血清（或荧光素偶联抗体所用物种的血清）的PBS。 含2%正常山羊血清和0.3%吐温-100的PBS MHC I类分子-FITC偶联四聚体 抗FITC抗体，例如BioDesign兔抗FITC 与多种物种IgG高度交叉吸附的荧光素偶联抗兔IgG，适用于多重标记，例如Cy3标记的山羊抗兔IgG 经高度交叉吸附处理的荧光素标记抗小鼠 IgG，适用于多重标记 新鲜的 PBS 缓冲液配制的 4% 多聚甲醛 0.01M 尿素 含 4mg/ml 没食子酸丙酯的甘油/明胶
特殊设备
振动切片机 手术刀 剃须刀片 手术剪 Loctite 快速固化瞬干胶（产品编号 #46551） 镊子 #2 驼毛画笔。可用剃刀片修剪至所需粗细 24孔平底组织培养板，例如 Falcon 目录号 #353226 组织腔室 锡箔 纸板载玻片夹，例如 Fisher 目录号 12-587-10 共聚焦显微镜
IST试剂快速参考
PBS-H（含肝素的磷酸盐缓冲液）
450 ml 1× PBS 50 ml 1X PBS + 10X 肝素
1x PBS + 10X 肝素
500 ml 1X PBS 500 mg 肝素粉末（存放于干燥化学品储存架）
PBS-H/2% NGS（正常山羊血清）
49 ml PBS-H，置于 Falcon 管中 1 ml NGS（存放于-20℃冰箱中，以1 ml分装）
PBS-H/2% NGS/0.3% Triton X-100
49 ml PBS-H/0.3% Triton X-100，置于 Falcon 管中 1 ml NGS（存放于-20℃冰箱中，以1 ml分装）
PBS-H/0.3% Triton X-100
500 ml PBS-H 1.5 ml Triton X-100（这是一种在干燥化学品储存架上找到的黏稠液体）
4% LMP 琼脂糖
2 g LMP琼脂糖粉末 50 ml PBS 振荡至混合均匀，微波加热至粉末溶解。
GG-NPG（含正丙基没食子酸酯的明胶甘油）
将一瓶甘油明胶置于50度水浴中融化 加入0.06 g没食子酸丙酯（位于Terri的架子上），充分振荡混匀 置于水浴中，间歇摇动，直至溶解。 分装至1 ml离心管（棕色管）中
4% 多聚甲醛
4 g 多聚甲醛粉末（存放于干燥化学品储存架） 在量筒中加入约10 ml PBS-H，再加入pf粉末 加水至体积约为 70 ml 加入一滴管 NaOH。 搅拌至溶解（通常约20-30分钟） 加入 HCl，直至 pH 达到 7–8。 加水至 100 ml。
0.01 M 尿素
0.3 g 尿素（存放于干燥化学品储存架） 500 ml 水