血管生成是指从已有的脉管系统中萌发出新的血管，这一过程与生理性和病理性活动均相关。本文展示了一种主动脉环实验方法，该方法允许将促血管生成因子或抑制剂直接加入培养中的主动脉环。通过在6至12天内观察主动脉环，可评估其出芽情况及新生血管的生长。
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本文内容
摘要
摘要
血管生成，即从已有血管系统中萌发出新血管的过程，与生理性和病理性过程均密切相关。多种血管生成检测方法涉及在体外培养条件下对单个内皮细胞的研究（1）。主动脉环检测是一种基于器官培养的血管生成模型（改良自（2））。简言之，切除小鼠胸主动脉，去除脂肪层和外膜，切成约1 mm长的环状片段。将单个主动脉环嵌入含基底膜基质提取物（BME）的小型固态凝胶圆顶中，凝胶置于48孔板各孔内。可直接向主动脉环中添加促血管生成因子或抗血管生成抑制剂，并可采用主动脉环与其他细胞类型的混合共培养体系，以研究旁分泌性血管生成效应。通过体视显微镜在6至12天内定期观察血管出芽情况。由于主动脉片段存在不均一性，可能导致较大实验变异，因此强烈建议每组设置6个重复孔。整个实验过程中通过相差显微镜监测新生血管的生长，并采集上清液用于检测相关促血管生成和抗血管生成因子、细胞死亡标志物及亚硝酸盐含量。
方案
实验前一天：
- 将 BME（减少生长因子，Cultrex，Trevigen）置于冰上或 4°C 下解冻；解冻后置于冰上保存，防止重新凝固。
实验当天：
- 将小鼠（6-7周龄）进行麻醉并放血处死。
- 取出胸主动脉，置于盛有冷的无菌PBS的培养皿中。
- 机械去除周围脂肪组织。注意：在整个操作过程中避免主动脉干燥。
- 使用手术刀片将主动脉均匀切成1 mm长的环状片段。切口必须整齐且均匀。
- 将主动脉环转移至新鲜的冷PBS中，并始终置于冰上保存。
- 使用预冷的移液器吸头，向48孔板的每个孔中加入约150 µl冷的BME，形成圆润的液滴。在37°C下孵育20-30分钟，使BME液滴凝固。
- 将单个主动脉环置于每个凝胶液滴顶部中央位置，在37°C下孵育10分钟。
- 在每个主动脉环上方再加入150 µl BME，于37°C下继续孵育20-30分钟。
- 配制培养基：人内皮细胞无血清培养基（GIBCO，Carlsbad, CA），添加2% FCS、50 单位/ml 青霉素和50 µg/ml 链霉素（Cellgro）。
- 向每孔中加入500 µl培养基，其中包含以下之一：
- 实验样品。
- 阳性对照：内皮细胞生长补充物（ECGS，终浓度200 µg/ml，BD Biosciences）。
- 阴性对照：仅培养基。
- 将培养板在37°C孵育12天，在第6至第12天之间使用标准相差体视显微镜拍摄主动脉环图像。
- 可选步骤：收集上清液。
注意事项：
- 始终保持无菌条件。
- 避免将气泡引入BME中。
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讨论
主动脉环实验是评估促血管生成因子及抗血管生成因子的有效工具。从主动脉环中长出的血管会募集平滑肌细胞和周细胞，与内皮细胞管状结构相结合，因此在解剖结构上与新生血管相似 体内此外，小鼠主动脉环实验具有该物种可利用的大量转基因工具的优势。然而，主动脉环实验也存在若干缺点。首先，血管的出芽生长 体内 发生于微血管而非主动脉等大血管。其次，血管环处理方式的不一致以及血管上残留周围组织的量均可能影响血管出芽。不同主动脉来源、不同小鼠年龄及品系也可能干扰血管生成反应。最后，血管新生出芽为三维结构，不利于拍照和定量分析。综上所述，在设置充分的内部对照并进行多次重复的情况下，该实验方法相对简单、成本较低、信息丰富，且在生物学复杂性和相关性方面显著优于内皮细胞培养。
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参考文献
- Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvascular Research. 74, 172-183 (2007).
- Masson, V., Devy, L., Grignet-Debrus, C., Bernt, S., Bajou, K., Blacher, S., Roland, G., Chang, Y., Fong, T., Carmeliet, P., Foidart, J. M., Noel, A. Mouse aortic ring assay: a new approach of the molecular genetics of angiogenesis. Biol. Proced. Online. 4, 24-31 (2002).
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