从土壤和沉积物中提取高分子量基因组DNA

摘要

本文描述了一种从土壤微生物群落中分离高分子量、高质量基因组DNA的方法。

摘要

土壤微生物组是一个庞大且尚未充分探索的基因组多样性与代谢创新资源库，与陆地生态系统中的养分和能量流动密切相关。无需培养的环境基因组学方法（也称为宏基因组学方法）有望以前所未有的方式获取这些遗传信息，用于代谢通路重建以及高价值治疗手段和生物质转化过程的功能筛选。然而，由于难以获得足够质量的高分子量DNA以构建大片段插入文库，土壤微生物组的研究仍然面临巨大挑战。本文介绍一种从土壤和沉积物中提取高分子量微生物群落基因组DNA的实验方案。所获得的基因组DNA质量理想，适用于构建大片段插入的环境基因组文库，进而用于后续的测序和功能筛选应用。

该实验流程从细胞裂解开始。微生物的细胞壁和细胞膜通过机械力（研磨）和化学作用（β-巯基乙醇）共同裂解。随后使用提取缓冲液、氯仿-异戊醇和异丙醇分离基因组DNA。用于裂解和提取步骤的缓冲液包含异硫氰酸胍和十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），以维持高分子量基因组DNA的完整性。根据后续应用需求，可进一步采用氯化铯（CsCl）梯度超速离心法对分离得到的基因组DNA进行纯化，以减少腐殖酸等杂质。第一个步骤即提取过程，大约需要8小时（不包括DNA定量步骤）；而CsCl梯度超速离心则需两天时间。在整个操作过程中，应轻柔处理基因组DNA以防止剪切，避免剧烈涡旋以及反复剧烈移液。

方案

第一部分：DNA 的提取

实验步骤

1. 处理6个样品（不含DNA定量）需要8小时。

在开始提取之前，需将研钵、研杵和刮勺置于 -20 °C 冰箱或使用液氮预冷。同时，将含有 20 ml 氯仿-异戊醇（24:1）的 50 ml 离心管置于冰上预冷。将杂交炉设定为 65 °C 进行预热。检查 CTAB 溶液，若出现结晶，需在 60 °C 温育以溶解晶体。在开始提取前，立即加入最后的组分以配制完全的变性溶液和提取缓冲液（见下文配方）。所有提取操作均应在通风橱中进行。

2. 配制变性缓冲液和提取缓冲液。
注意：为了获得最大的DNA产量，必须严格按照说明精确配制缓冲液。

3. 将2 g土壤放入预冷的研钵中。
注意：野外采集的土壤应在干冰上冷冻运输，并在-80 °C下保存。在进行DNA提取前，将土壤解冻并使用2 mm筛子过筛。起始土壤用量最多可增加至10 g。

4. 向土壤中加入 1 ml 变性溶液。

5. 在液氮中冷冻并研磨土壤₂ 用研杵研磨，直至土壤颗粒呈粉末状且均匀。重复冻融和研磨过程两次。
注意：研磨过程中需保持土壤样品处于冷冻状态，使用足量液氮完全覆盖土壤样品。研磨期间样品轻微融化是可接受的。

6. 使用预冷的刮勺将研磨后的土壤转移至50 ml锥形管中。
注意：如有需要，此时可将研磨后的土壤样品保存在-80 °C。

7. 加入 9 ml 裂解缓冲液。将溶液与土壤混匀，在低速下短暂涡旋振荡。
注意：为确保缓冲液均匀，使用前于 60 °C 温育 10–15 分钟。在整个提取过程中，其余缓冲液也需保持在 60 °C。涡旋振荡速度设为 8（量程上限为 10）。

8. 在杂交炉中于 65°C 孵育 40 分钟。孵育期间，以最低转速持续旋转离心管，或每 10 分钟轻轻翻转一次离心管。
注意：将离心管水平放置于杂交炉中，以使缓冲液与土壤在较大表面积上接触。孵育过程中溶液可能略显黏稠。

9. 在 10 - 14 °C 条件下，以 1800 ×g 离心 10 分钟。将上清液转移至预冷的含有 20 ml 氯仿-异戊醇（24:1）的 50 ml 尖底离心管中，并置于冰上保存。
注意：转移上清液时，注意不要搅动有机相（下层）。如有必要，可残留 1-2 ml 上清液，以确保仅收集澄清的上清液。上清液表面常可见一层浅黄褐色层（厚度约 1-3 mm），在收集上清液时切勿扰动此层。建议将移液枪头沿管壁缓慢滑动，以避免破坏该浅黄褐色层。若上清液过于浑浊，需对上清液再进行一次氯仿-异戊醇抽提。转移氯仿时，切勿使用一次性塑料移液枪头，因为氯仿会溶解塑料。应使用玻璃移液管、玻璃量筒，或将氯仿直接倒入 50 ml 尖底离心管中。

10. 再用土壤沉淀物提取 2 次；

10.1. 向土壤沉淀物中加入 5 ml 提取缓冲液，使用 1 ml 吸头轻轻混匀，然后在低速下短暂涡旋振荡。
注意：使用前需摇匀并混合缓冲液。

10.2. 在杂交炉中 65°C 孵育 10 分钟。在 10 - 14 °C 条件下以 1800 ×g 离心 10 分钟。
将上清液转移至第 9 步的离心管中。在提取过程中，将收集了上清液的离心管以及氯仿-异戊醇置于冰上保存。
注意：确保将上清液加入同一管中，避免样品之间发生交叉混合。

10.3. 再次重复 9.1 和 9.2 步骤一次。

11. 使用旋转板，非常轻柔地以1.25 rpm转速摇动含有收集的上清液（14–19 ml）和氯仿-异戊醇的离心管，持续10分钟。
注意：务必紧密关闭管盖，防止泄漏。在放置离心管前，先在摇动板上铺一张纸巾，以便及时发现任何泄漏。

12. 在 10 - 14 °C 条件下，以 1800 xg 离心 20 分钟。

13. 将水相转移至新离心管中。
注意：转移上清液时，不要扰动水相（上层）与有机相（下层）之间的界面。保留约1.5–2 ml上清液，以确保仅收集纯净的上清液。

14. 使用异丙醇回收 DNA（步骤 15.a - 21.a）。或者，如果预计样品中的生物量极低，导致异丙醇沉淀后形成的沉淀物几乎不可见且难以回收，则可使用 Amicon® Ultra-15 离心滤膜装置（步骤 15.b - 21.b）。

15.a. 将上清液转移至新的离心管中进行超速离心。

16.a. 按照 0.6:1 的体积比向收集的上清液中加入异丙醇。轻轻颠倒离心管数次以混匀。

17.a 在室温下孵育 30 分钟。

18.a. 在 20 - 25 °C 下，以 16000 ×g 离心 20 分钟。离心前务必确保所有离心管的重量平衡。
注意：在离心管上标记离心力的方向，以便在 DNA 产量较低时更容易识别 DNA 沉淀。

19.a. 通过倾倒或真空抽吸去除异丙醇。注意不要扰动DNA沉淀。
注意：离心结束后应立即去除异丙醇。操作时需格外小心，避免丢失DNA沉淀。DNA沉淀的大小因土壤类型而异，可能从肉眼清晰可见（约9 mm直径）到几乎不可见。建议沿离心管管壁小心抽吸，以去除残留的异丙醇，避免将DNA沉淀一并吸出。

20.a. 在室温下干燥DNA沉淀5 - 20分钟。
注意：不要将DNA沉淀过度干燥，否则将难以重新溶解。

21.a. 用 200 μl TE 重悬 DNA 沉淀，轻轻弹击混匀。将 DNA 溶液转移至 1.5 ml 离心管中，于 4°C 过夜放置，以充分溶解 DNA。
注意：根据沉淀的大小，可调整加入 TE 的体积，通常使用 200 - 400 μl TE 效果良好。

*或者按照步骤 15.b - 21.b 进行操作。

15.b. 预先清洗 Amicon® Ultra-15 离心滤膜装置；向装置中加入 15 ml TE 缓冲液，于 3500 ×g 离心 10 分钟。弃去滤过液。

16.b. 将步骤13中的DNA溶液加入经预清洗的Amicon滤膜管中。在3500 ×g 条件下离心，直至DNA体积浓缩至200 - 500 μl。弃去滤过液。

17.b. 用 TE 缓冲液洗涤 DNA 两次；向 Amicon 滤膜装置中加入 10 ml TE。在 3500 ×g 条件下离心，直至 DNA 体积浓缩至约 200 μl。弃去滤过液。重复操作一次。

18.b. 将滤膜上的DNA溶液转移至新的1.5 ml离心管中。

19.b. 向 Amicon 滤器中加入 40 μl TE。通过上下吹打回收滤膜两侧可能残留的 DNA。将此洗涤液加入第 18.b 步的离心管中。

20.b. 如有必要，可使用 Microcon® Ultracel YM-30 离心过滤装置进一步浓缩 DNA；通过加入 200 μl TE 缓冲液并在 10000 ×g 离心 7 分钟，预先清洗滤膜。将 DNA 溶液加入滤膜中，在 5000 ×g 离心 1 分钟。重复离心，直至滤膜上的 DNA 溶液体积减少至约 50 μl。
注意：Microcon 滤膜的最大初始样品体积为 500 μl。离心速度不得超过 14000 × g。切勿过度离心至膜完全干燥。离心后应确保滤膜表面仍被液体覆盖。若已过度离心导致膜干燥，请加入 15 μl TE 缓冲液，轻轻振荡 30 秒，然后继续进行步骤 21.b。

21.b. 将滤膜单元倒置放入一个新的 Microcon 管中，在 1000 × g 离心 3 分钟以回收 DNA。

22. 通过TAE凝胶（0.8%，0.5×TAE，50 V电泳4小时）以及Nanodrop分光光度计或Pico-green法结合酶标仪对DNA进行定量。
注意：可通过将样品条带与凝胶上已知浓度的marker条带（高分子量DNA marker或λHindIII）进行比较，估算DNA含量。

23. 使用脉冲场凝胶电泳（PFGE）检测高分子量 DNA 的完整性，凝胶为 1% 的 1×TAE 琼脂糖凝胶（更多细节请参见 Taupp et al. 2009 的 JoVE 文章，步骤 II，第二部分，网址：https://www.jove.com/index/details.stp?id=1387，doi: 10.3791/1387）。
注意：此质量控制步骤可使用普通琼脂糖凝胶，无需低熔点琼脂糖。简要而言，电泳条件如下：分离范围 2–250 kb，电压 6 伏，初始切换时间 5 秒，最终切换时间 15 秒，14 °C 下运行 12 小时。使用 SYBR Gold 染色 1 小时以在凝胶上显示 DNA。

24. 如果提取的DNA分子量符合要求，则继续进行以下的CsCl梯度离心步骤。或者，DNA可在CsCl离心前于-20 °C或-80 °C保存。
若要构建大片段插入的宏基因组DNA文库，DNA的中位大小应等于或超过36 Kb。

第二部分. 使用氯化铯梯度超速离心法进行 DNA 纯化

离心机准备：1.5 - 2 小时
离心步骤：18 小时
离心后去除溴化乙锭（EtBr）并浓缩 DNA：3 小时

步骤

详情请参见 Wright et al. 2009. https://www.jove.com/index/details.stp?id=1352，doi: 10.3791/1352

代表性结果/成果

从2 g森林土壤有机层（O层）和矿质层（Ae、AB和Bt层）中提取的基因组DNA总量（样品采自加拿大不列颠哥伦比亚省斯库洛湖的长期土壤生产力（LTSP）研究站点，由不列颠哥伦比亚省林业与土地管理部负责管理）介于10 mg至180 mg之间。所提取DNA的中位片段大小通常在40–60 kb范围内（图1）。260 nm与280 nm处的吸光度比值为1.3–1.6，在230 nm处出现吸收峰，可能表明存在土壤样品中常见的腐殖酸污染。经CsCl梯度离心后，此类污染显著减少，且260/280比值提升至1.8–1.9，如图2a和2b所示。

图1. CsCl超速离心前提取的基因组DNA的脉冲场凝胶电泳（PFGE）图谱。泳道1：1 kb标记物，100 ng；泳道2：λHind III标记物，100 ng；泳道3：λHind III标记物，250 ng；泳道4：λHind III标记物，500 ng；泳道5：Fosmid 36 kb标记物，100 ng；泳道6和7：从LTSP定位点Skulow湖的矿质土壤Ae层分离的基因组DNA；泳道8和9：从同一地点矿质土壤AB层分离的基因组DNA

图 2. 基因组 DNA 在 CsCl 超速离心前（A）和后（B）通过分光光度计检测的吸收图谱。注意 CsCl 超速离心后 230 nm 波长处吸光度值的降低，表明基因组 DNA 质量得到提升。请点击此处查看图 2 的放大版本。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>变性溶液总共 10 ml
硫氰酸胍（分子量 118.16），4.73 g
1 M Tris-HCl（pH 7.0），100 μl
0.5 M EDTA，20 μl
加水至总体积为9.95 ml。
高压灭菌器
加入50 μl 2-巯基乙醇–使用前立即加入乙醇。(5 μ2-巯基乙醇–乙醇每1毫升变性溶液
注意：将变性溶液保持在 4 °C. 不要使用超过一周的缓冲液。如有可能，应配制新鲜缓冲液使用。
<强>**提取缓冲液**
1M 磷酸钠缓冲液 [pH 7.0]*，100 ml
1 M Tris-HCl [pH 7.0]，100 ml
0.5 M EDTA [pH 8.0]，200 ml
5 M NaCl，300 ml
高压灭菌并在室温下保存。
使用前加入200 ml 5% 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，已高压灭菌）和100 ml 20% SDS（已高压灭菌）。如果CTAB出现结晶，需在60℃下熔化 °C.
* 1 M 磷酸钠缓冲液：57.7 ml，1 M 磷酸二氢钠（NaH₂PO₄）2PO4) 和 42.3 ml 1 M 磷酸氢二钠（NaH2PO4）。将pH值调节至7.0
注意：如果 20 % SDS 出现沉淀，则不得使用。将 SDS 加入溶液时，出现乳白色悬浮物属正常现象。加入 SDS 后，立即将提取缓冲液置于 60 ℃ °C，以确保SDS充分悬浮。