本文描述了一种从土壤微生物群落中分离高分子量、高质量基因组DNA的方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
土壤微生物组是一个庞大且尚未充分探索的基因组多样性与代谢创新资源库，与陆地生态系统中的养分和能量流动密切相关。无需培养的环境基因组学方法（也称为宏基因组学方法）有望以前所未有的方式获取这些遗传信息，用于代谢通路重建以及高价值治疗手段和生物质转化过程的功能筛选。然而，由于难以获得足够质量的高分子量DNA以构建大片段插入文库，土壤微生物组的研究仍然面临巨大挑战。本文介绍一种从土壤和沉积物中提取高分子量微生物群落基因组DNA的实验方案。所获得的基因组DNA质量理想，适用于构建大片段插入的环境基因组文库，进而用于后续的测序和功能筛选应用。
该实验流程从细胞裂解开始。微生物的细胞壁和细胞膜通过机械力（研磨）和化学作用（β-巯基乙醇）共同裂解。随后使用提取缓冲液、氯仿-异戊醇和异丙醇分离基因组DNA。用于裂解和提取步骤的缓冲液包含异硫氰酸胍和十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），以维持高分子量基因组DNA的完整性。根据后续应用需求，可进一步采用氯化铯（CsCl）梯度超速离心法对分离得到的基因组DNA进行纯化，以减少腐殖酸等杂质。第一个步骤即提取过程，大约需要8小时（不包括DNA定量步骤）；而CsCl梯度超速离心则需两天时间。在整个操作过程中，应轻柔处理基因组DNA以防止剪切，避免剧烈涡旋以及反复剧烈移液。
方案
第一部分：DNA 的提取
实验步骤
1. 处理6个样品（不含DNA定量）需要8小时。
在开始提取之前，需将研钵、研杵和刮勺置于 -20 °C 冰箱或使用液氮预冷。同时，将含有 20 ml 氯仿-异戊醇（24:1）的 50 ml 离心管置于冰上预冷。将杂交炉设定为 65 °C 进行预热。检查 CTAB 溶液，若出现结晶，需在 60 °C 温育以溶解晶体。在开始提取前，立即加入最后的组分以配制完全的变性溶液和提取缓冲液（见下文配方）。所有提取操作均应在通风橱中进行。
2. 配制变性缓冲液和提取缓冲液。
注意：为了获得最大的DNA产量，必须严格按照说明精确配制缓冲液。
3. 将2 g土壤放入预冷的研钵中。
注意：野外采集的土壤应在干冰上冷冻运输，并在-80 °C下保存。在进行DNA提取前，将土壤解冻并使用2 mm筛子过筛。起始土壤用量最多可增加至10 g。
4. 向土壤中加入 1 ml 变性溶液。
5. 在液氮中冷冻并研磨土壤2 用研杵研磨，直至土壤颗粒呈粉末状且均匀。重复冻融和研磨过程两....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
我们感谢加拿大创新基金会、不列颠哥伦比亚知识发展基金、不列颠哥伦比亚基因组学中心以及不列颠哥伦比亚森林与范围部对森林土壤生产力持续研究的支持。S.L. 获得了由TULA基金会资助的微生物多样性与进化中心提供的博士后奖学金支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>变性溶液总共 10 ml | |||
| 硫氰酸胍（分子量 118.16），4.73 g | |||
| 1 M Tris-HCl（pH 7.0），100 μl | |||
| 0.5 M EDTA，20 μl | |||
| 加水至总体积为9.95 ml。 | |||
| 高压灭菌器 | |||
| 加入50 μl 2-巯基乙醇–使用前立即加入乙醇。(5 μ2-巯基乙醇–乙醇每1毫升变性溶液 | |||
| 注意：将变性溶液保持在 4 °C. 不要使用超过一周的缓冲液。如有可能，应配制新鲜缓冲液使用。 | |||
| <强>**提取缓冲液** | |||
| 1M 磷酸钠缓冲液 [pH 7.0]*，100 ml | |||
| 1 M Tris-HCl [pH 7.0]，100 ml | |||
| 0.5 M EDTA [pH 8.0]，200 ml | |||
| 5 M NaCl，300 ml | |||
| 高压灭菌并在室温下保存。 | |||
| 使用前加入200 ml 5% 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，已高压灭菌）和100 ml 20% SDS（已高压灭菌）。如果CTAB出现结晶，需在60℃下熔化 °C. | |||
| * 1 M 磷酸钠缓冲液：57.7 ml，1 M 磷酸二氢钠（NaH₂PO₄）2PO4) 和 42.3 ml 1 M 磷酸氢二钠（NaH2PO4）。将pH值调节至7.0 | |||
| 注意：如果 20 % SDS 出现沉淀，则不得使用。将 SDS 加入溶液时，出现乳白色悬浮物属正常现象。加入 SDS 后，立即将提取缓冲液置于 60 ℃ °C，以确保SDS充分悬浮。 |
参考文献
- Hurt, R. A., Qiu, X., Wu, L., Roh, Y., Palumbo, A. V., Tiedje, J. M., Zhou, J. Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments. AEM. 67 (10), 4495-4503 (2001).
- Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA extraction from 0.22 μM Steri....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
