引物延伸捕获：从高度降解的DNA样本中靶向获取序列

摘要

我们介绍了一种靶向获取古DNA序列的方法，并利用该方法重建了五名尼安德特人个体的完整线粒体基因组。将这些序列与现代人类进行比较表明，尼安德特人长期具有较低的有效种群规模。

摘要

我们提出一种从严重降解且富含微生物DNA污染的DNA样本中靶向获取特定DNA序列的方法，此类样本常见于古代骨骼。与直接PCR或鸟枪法测序相比，该方法显著减少了样本损耗和测序工作量。我们利用该技术重建了地理分布广泛的五名尼安德特人（Neandertals）的完整线粒体DNA（mtDNA）基因组。晚期尼安德特人的mtDNA遗传多样性约为现代人类的三分之一。结合对mtDNA编码蛋白进化的分析，这些数据表明尼安德特人的长期有效种群规模小于现代人类以及现存的大型类人猿。

方案

该方法已用于 Briggs 等人在《科学》杂志 325 卷（5938 期）第 318–321 页（2009 年）发表的研究中，详见 Briggs et al., Science 325 (5938). 318-321 (2009)。

所需试剂：

• AmpliTaq Gold DNA 聚合酶
• 10x GeneAmp PCR 缓冲液 II
• MgCl₂ 25 mM
• dNTP 混合液，每种 25 mM
• BSA，10 mg ml^-1 水溶液
• 分子生物学级水
• EB 缓冲液（随 MinElute PCR 纯化试剂盒提供）；10 mM Tris HCl，pH 8.5
• MinElute PCR 纯化试剂盒
• M-270 链霉亲和素 Dynabeads 磁珠
• 2x 结合与洗涤（BW）缓冲液（2 M NaCl，10 mM Tris-Cl，1 mM EDTA，pH 8.0，0.2% Tween 20）
• 1x 结合与洗涤（BW）缓冲液（将 2x BindWash 缓冲液用水平衡稀释 2 倍）
• 热洗（HW）缓冲液（2.5 mM MgCl，1X Taq Gold 缓冲液，0.1% Tween 20）

有关非标准试剂和设备的制造商信息，请参见后面的表格。

1）文库扩增

1. 此处的 DNA 模板是根据 (Rohland and Hofreiter, 2007a, 2007b) 和 (Maricic and Pääbo, 2009) 所述方法，从低拷贝数 DNA 来源制备的 454 文库。为扩增整个文库，请配制以下 PCR 反应体系：

   试剂	每反应 μl
   水	45
   10X Gene Amp PCR buffer II	10
   MgCl2 (25 mM)	10
   BSA (10 mg / ml)	2
   dNTPs (各 25 mM)	1
   454 emPCR 正向引物/10 μM	3
   454 emPCR 反向引物/10 μM	3
   AmpliTaq Gold DNA 聚合酶 (5 U / μl)	1
   454 DNA 文库模板	25
   总量	100

2. 在热循环仪中使用以下 PCR 程序进行 14 个循环 的扩增：
   1. 95°C 12 分钟
   2. 95°C 30 秒
   3. 60°C（或所需退火温度）1 分钟
   4. 72°C 1 分钟
   5. 返回步骤 2（重复 13 次）
   6. 72°C 5 分钟
   7. 10°C ∞
3. 按照生产商说明书，使用 Qiagen MinElute 离心柱纯化反应产物。用 50 μl EB 缓冲液洗脱。
4. 使用 qPCR (Meyer et al., 2007) 对纯化后的扩增产物以及未扩增文库的等分试样进行定量。若扩增产物浓度超过每微升 1 × 10¹² 拷贝，则在后续的引物延伸步骤中减少模板用量，以确保加入引物延伸反应的拷贝数不超过 2 × 10¹²。

2）引物延伸

1. 根据所需的反应数量配制主混合液。

   试剂	每反应 μl 数
   水	45
   10X Gene Amp PCR buffer II	10
   MgCl2 (25 mM)	10
   BSA (10 mg/ml)	2
   dNTPs (每种 25 mM)	1
   454 emPCR 正向引物/10 μM	3
   454 emPCR 反向引物/10 μM	3
   AmpliTaq Gold DNA 聚合酶 (5 U/μl)	1
   454 DNA 文库模板	25
   总计	100

2. 在热循环仪中运行以下程序，进行 单引物延伸 反应：
   1. 95°C 12 分钟
   2. 60°C（或根据你的 PEC 引物退火温度调整）1 分钟
   3. 72°C 5 分钟
   4. 72°C 持续保温！
      
      关键步骤 延伸反应完成后，将反应体系保持在 72°C。随后在未从加热模块取出反应管前，直接向管中加入 150 μl PBI 或 PB 缓冲液（用于 QIAGEN MinElute 纯化）。此操作至关重要，可防止混合物冷却过程中发生非特异性引物退火及非目标产物的捕获。
3. 按照生产商说明书，使用 Qiagen MinElute 离心柱纯化反应产物，用 50 μl EB 洗脱。

3) 扩增产物捕获

1. 通过涡旋振荡重悬 M-270 磁珠的储存液。每个样品取出 25 μl 磁珠悬液。用 500 μl 2×BW 缓冲液洗涤磁珠两次，并将磁珠重悬于每份样品 25 μl 的 2×BW 缓冲液中。
2. 将步骤 2.3 中得到的 25 μl 洗脱液加入到步骤 3.1 中得到的 25 μl 磁珠悬液中。混匀后，在室温下旋转孵育 15 分钟。
   
   建议：保留步骤 2.3 中剩余的 5 μl 洗脱液用于 qPCR 定量。
   
   
3. 将全部混合物转移至新的 1.5 ml 离心管中（此举有助于减少非目标文库片段的残留）。使用磁性颗粒收集器（MPC）沉淀并弃去上清液。
4. 用 500 μl 1×BW 缓冲液洗涤 5 次（多次洗涤有助于尽可能去除背景信号）。最后一次洗涤后，短暂离心并彻底去除残留的上清液。
5. 加入 500 μl 1×热洗（HW）缓冲液。在 65 °C（或比 PEC 引物 Tm 高 5 °C）的温控模块中振荡 2 分钟。此步骤后需迅速移除上清液，以尽量减少降温。 （此步骤旨在去除仍与 PEC 引物结合但未在延伸步骤中实际延伸的背景片段）。彻底去除残留的上清液。
6. 将磁珠沉淀重悬于 30 μl EB 缓冲液中。将全部混合物转移至新的 1.5 ml 离心管中（此举有助于减少非目标文库片段的残留）。在热循环仪中 95 °C 孵育 3 分钟以进行洗脱。放入磁性颗粒收集器中，小心分离上清液，注意保留磁珠。

4) 捕获产物扩增

1. 为所需数量的样本配制PCR预混液。

   试剂	每反应微升
   水	45
   10X Gene Amp PCR 缓冲液 II	10
   MgCl₂2 (25 mM)	10
   BSA（10 mg / ml）	2
   dNTPs（各25 mM）	1
   454 emPCR 正向引物/10 μM	3
   454 emPCR 反向引物/10 μM	3
   AmpliTaq Gold DNA聚合酶（5 U/μl）	1
   洗脱的捕获产物	25
   总计	100

2. 在 Thermo 定量 PCR 仪中使用以下 PCR 程序 14 个循环 扩增：
   1. 95°C 12分钟
   2. 95°C 30秒
   3. 60°C（或所需退火温度）1 分钟
   4. 72°C 1 分钟
   5. 前往 2 (x 13)
   6. 72°C 5分钟
   7. 10°C ∞
3. 使用Qiagen MinElute硅胶离心柱，按照制造商说明书纯化反应产物，用50 μl EB缓冲液洗脱。所得产物可直接用于第二轮捕获（从步骤2.1开始），或直接进入454乳液PCR流程进行测序。

代表性结果：

初次使用PEC实验方案时，强烈建议首先进行捕获反应，即将少量“阳性对照靶序列”（例如约100 bp的PCR产物，1皮克已足够）与常规推荐量的扩增后454文库模板混合（参见步骤2.1），并使用一条专门针对该阳性对照产物设计的PEC引物进行捕获。若进行此对照反应，可通过针对阳性对照特异性和454接头特异性的两对引物分别进行qPCR，定量分析纯化的引物延伸反应（1.3）、引物延伸产物（2.3）以及洗脱的磁珠捕获产物（3.6）中“对照靶标”与背景信号的含量。通过该方法，可直接评估实验条件下背景去除的效果（“特异性”）以及靶标回收的效率（“灵敏度”）。

一个成功的 PEC 方案通常具有以下特性——

灵敏度（通过整个实验流程中保留的对照目标物的量来测定）：
洗脱的磁珠捕获产物中对照目标物的总量（3.6）约为纯化的引物延伸反应中总对照目标物的1–20%（2.3）。

背景（通过454 emPCR引物对测定）：
洗脱珠捕获产物中的总背景量（3.6）不足纯化后的引物延伸反应中总背景量的< 0.01%（2.3）。

如果最终产物中剩余的目标物质少于1%，则引物延伸步骤可能未成功，应进行排查。

如果最终产物中残留的背景物质超过0.01%，则可能洗涤步骤操作不当，需进行排查。

讨论

PEC 方法简单、快速、灵敏且特异。因此，我们作者认为该方法在古DNA以外的领域也有多种应用，例如从RNA文库中捕获小RNA片段、检测混合样本中的结构变异，或从宏基因组样本中捕获16S（或其他位点）的多样性。需要指出的一点是，随着多重捕获反应中PEC引物数量的增加，捕获的灵敏度会降低。因此，PEC方法并不适用于非常大范围（例如兆碱基或更大）的目标区域捕获，但非常适合快速捕获来自多个个体的小目标区域甚至单核苷酸多态性（SNP）位点。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
GeneAmp PCR buffer II 和 MgCl2 中的 AmpliTaq Gold 聚合酶	Applied Biosystems	N8080241
QIAGEN MinElute PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28004
M-270 链霉亲和素磁珠	Invitrogen	653.05
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287
DynaMag-2 磁性分离器	Invitrogen	120.02D