无创 体内 小动物 MRI 与 MRS：基本实验操作程序

摘要

本研究描述了非侵入性小型动物磁共振成像（MRI）和磁共振波谱（MRS）的基本操作流程 体内.

摘要

小型动物磁共振（MR）研究因其无创性以及所提供的丰富生物学信息，已成为现代生物医学研究的重要组成部分。MR 不需要使用电离辐射，与其它断层成像或光谱技术相比，能够以无创方式提供更高的分辨率和更优的信噪比。在本方案中，我们将重点介绍小型动物磁共振成像和磁共振波谱（MRI/MRS），用于无创获取弛豫加权的¹小鼠的 H 图像并获取³¹小鼠肌肉的P谱。本工作并非旨在涵盖小动物MRI/MRS的各个方面，而是介绍小鼠MRI/MRS实验的基本操作流程。本工作的主要目标是向研究人员说明进行MRI/MRS实验所需的基本步骤in vivo小型动物的磁共振实验。目的是帮助研究人员更好地理解基本的实验操作流程，使刚进入磁共振领域的研究者能够更合理地规划研究中非磁共振部分的内容，从而实现磁共振与非磁共振实验步骤的无缝整合。

方案

第一部分：磁体安全

磁共振成像（MRI）和磁共振波谱（MRS）均使用强磁场，需格外谨慎。例如，本研究使用的4.7 T仪器，其磁场强度约为地球磁场的90,000倍。即使磁共振扫描仪未在使用中，其高磁场也始终处于开启状态。任何金属物体一旦进入如此强的磁场范围，都会被磁体强烈且迅速地吸引。若实验受试者或操作人员位于飞向磁体的金属物体的路径上，则极其危险。因此，进行磁共振实验的人员在进入仪器附近区域前，应仔细检查并移除衣物上的任何金属物品，并确保周围环境无此类物体。有关磁体安全的更详细信息可参见文献¹及以下网页：http://www.imrser.org/。金属材料的存在不仅会引发上述安全问题，还可能通过引入成像/波谱伪影而干扰实验结果。成像对象附近或内部存在的金属材料会改变局部磁场，从而在所获取的图像上产生伪影，或导致波谱谱线展宽。

因此，在对动物进行磁共振操作时，应将钱包、钥匙、笔等物品留在磁体外。

第二部分： 体内 水平磁体中老鼠的磁共振成像

MRI 动物准备

1. 所有动物操作在实施前必须获得机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。
2. 我们使用气化异氟烷对动物进行磁共振成像（MRI）实验的麻醉。动物麻醉也可使用其他麻醉剂，如阿戊巴比妥（avertin，即2,2,2-三溴乙醇或TBE）或氯胺酮与赛拉嗪的混合制剂。每种麻醉剂的剂量信息见表1。
3. 用塑料背衬的吸水垫（蓝色垫或chuck）铺垫诱导室。将一只小鼠（或多只小鼠用于多只小鼠成像）放入诱导室中。
4. 将异氟烷蒸发器的流量计调节至0.8–1.5 L/min，然后将异氟烷蒸发器浓度调至4%，持续约2–3分钟。
5. 当动物达到外科麻醉深度（即无足趾夹捏反应）后，将其置于动物固定装置上，鼻部插入鼻罩（或面罩）。进行头部成像时可使用头部固定器，进行身体成像时可使用身体固定器。
6. 动物固定装置用于防止潜在的运动；市面上有多种商用固定装置。此外，也可根据实验设置的特殊需求定制设计固定装置。若使用定制固定装置，务必仅使用非磁性材料。
7. 在成像期间，将流量计调节至0.4–0.8 mL/min，并将异氟烷蒸发器浓度降低至1.2–1.5%。从小鼠鼻罩排出的废气通过泵收集，并导入实验室内部的真空系统中。
8. 动物的眼睛将使用无菌眼用润滑软膏保持湿润。实验期间，动物体温将通过循环温水系统维持在35–37°C。也可使用其他类型的热源，例如加热垫或将暖空气吹入射频（RF）线圈内。
9. 配备动物监测系统，用于监测体温、呼吸/心率周期，并实现呼吸/心脏门控与图像采集的同步。
10. 在动物旁边放置一个由琼脂糖制成的标准样品，用于监测信号的突发性变化。该标准琼脂样品在多层面和多时间点成像中尤为有用。当在所获取图像的某一层面中检测到意外的信号变化时，可剔除该层面；此外，在图像后处理分析中，可根据标准样品的信号变化对其实信号强度进行校正。
11. 将动物及监测组件牢固地安置在动物固定装置上后，将固定装置置于射频（RF）线圈的中心位置。
12. 将射频（RF）线圈移至磁体室，并将其插入磁体内已放置好的循环温水系统中。图2展示了从磁体孔前端观察到的磁共振成像仪的多个组成部分。

磁共振成像实验

1. 使用磁共振扫描仪的调谐面板，将射频线圈调谐至¹H共振频率，并将线圈的特征阻抗匹配至50欧姆，以实现最佳信号接收条件。大多数用于人体的磁共振成像仪在常规成像中无需单独进行调谐/匹配操作，但在磁共振波谱（MRS）实验中除外。
2. 使用单脉冲序列进行匀场（shimming）处理。磁共振信号依赖于环境磁场的均匀性。匀场过程可使感兴趣区域内的磁场尽可能均匀。每台磁共振扫描仪均有其特定的匀场方法，包括快速自动匀场技术，如快速场图法（fast map）和梯度匀场法。
3. 通过最大化一维图像轮廓来优化射频脉冲。在保持脉冲长度恒定且重复时间（TR，即弛豫延迟）足够长（约为组织T₁值的3–5倍）的条件下，可调节射频脉冲功率。
4. 沿三个正交方向采集定位像，以生成轴向、冠状和矢状图像。可采用快速成像序列（如梯度回波或快速自旋回波成像序列）采集定位像。所获得的图像将用于规划后续正式成像的扫描平面。
5. 切换至自旋回波序列。选择合适的序列参数：重复时间（TR，即弛豫延迟）应为组织T₁值的3至5倍，以获取完全弛豫的图像，如质子密度加权或T₂加权图像。回波时间（TE）是指第一个射频脉冲与回波信号中心之间的时间间隔。可根据所需图像对比度选择适当的TE值，具体如表2所示。图2展示了在一只背部接种异种移植肿瘤的裸鼠上，利用不同T₁、T₂和T₂*弛豫效应获得的活体图像。
6. T₂测量可通过多回波成像或使用多个TE值的单回波成像来完成。
7. 在完成磁共振成像（MRI）/磁共振波谱（MRS）活体实验后，应对动物在整个恢复过程中进行密切监测。磁共振成像结束后，应将动物从射频线圈中取出，并持续观察直至其完全恢复后放回笼中。麻醉状态下的小鼠散热迅速，因此需用纱布垫或毛巾覆盖动物和/或提供热源，以维持体温，直至其从麻醉中完全恢复。

图像处理

1. 在MR控制台查看采集的图像，并将选定的数据传输至后处理计算机。
2. 我们通常使用ImageJ（http://rsbweb.nih.gov/ij/）进行图像分析。图像分析包括图像缩放/滤波、T₁、T₂和扩散系数的计算、肿瘤体积测量以及肿瘤的分割。

第3部分. 垂直孔径磁体中用于小鼠后肢骨骼肌的活体磁共振波谱（MRS）

构建用于诱导可逆性缺血的套管

1. 取一段外径约为 5-7 mm、内径为 12-15 mm 的 PVC 管。在该管壁上钻一个小孔，并攻出螺纹。
2. 剪取一段两端开口的气球（氦气球材质效果最佳）。将此段气球从 PVC 管中穿过，并反向包裹，将两端在 PVC 管外壁上用胶带固定在一起。
3. 使用热缩管将气球两端在管子周围密封。此时应形成一个具有坚固外壁和可充气内壁的袖带。
4. 在螺纹孔周围裁剪掉部分热缩管和气球材料，注意在孔与 PVC 管边缘之间保留足够的材料。将一段长 1.5 cm 的非铁金属材料（例如黄铜）旋入 PVC 管上的孔中，以便对袖带进行充气。用 5 分钟环氧树脂密封该区域。
5. 将该袖带固定在 MRS 探头的射频线圈旁，并连接至外部血压计。

定制呼吸监测仪

1. 我们使用一种定制的呼吸监测仪，该监测仪设计为可兼容磁体孔径内的有限空间和受限的进入条件。市面上也有多种商用型号可供选择。
2. 将一个小气球绑在耐拉伸导管的一端，并将导管插入探头中。
3. 将导管的另一端连接至压力传感器。
4. 确保管路和气球内部无气泡。气泡会减弱因小鼠呼吸导致身体运动而引起气球受压所产生的信号。

小鼠在磁共振波谱探头中的定位

1. 用5%阿佛丁（Avertin）麻醉小鼠（剂量为0.010 ml/g体重）。
2. 待小鼠达到手术麻醉深度后，将其仰卧置于小鼠支撑装置上，并将充满液体的气囊放置于小鼠腹侧，用小鼠固定带将其固定。
3. 将小鼠及其支撑装置放入MRS探头中。
4. 将一条后肢穿过缺血套管和MRS线圈，尽可能使腿部位于线圈中心。此设置可使小鼠身体在垂直孔径磁体中保持水平位置（图3）。
5. 用胶带将足部固定在刚性支撑物上，以固定腿部位置。
6. 将热电偶皮下植入后肢中，但需避开线圈采样区域。
7. 使用眼用润滑软膏润湿眼睛，防止角膜干燥。覆盖小鼠眼睛和面部，避免其与探头内壁摩擦或受刺激。
8. 可根据实验的具体需求添加其他监测探头。

设置磁共振波谱实验

1. 将气流连接至MRS探头的加热元件。
2. 在VNMR软件中设置变温控制单元，以维持腿部温度在35–37 °C。
3. 使用MRS软件中的调谐面板，对¹H和³¹P共振频率进行线圈频率调谐和阻抗匹配。
4. 调节匀场电路，利用¹H波谱法优化感兴趣区域中B1磁场的均匀性。
5. 切换至³¹P频率，确定射频脉冲宽度，以从一次自由感应衰减（FID）中获得最大信号（90°时间）。
6. 采集高信噪比、完全弛豫状态下的谱图（FRS），用于确定无机磷酸盐（P_i）和磷酸肌酸（PCr）相对于ATP在完全弛豫条件下的比值。这些谱图使用90°时间采集，FID采集之间的重复时间（TR）约为PCr的T₁的5倍（在7 T下为20秒）。这些数据将用于从磁共振波谱中定量分析PCr和P_i水平。

缺血实验

1. 一种简单的缺血扰动可通过测量缺血期间及缺血后即刻磷酸肌酸的变化，来确定静息和最大线粒体ATP生成。
2. 设置阵列以使用多光谱采集系统收集多个光谱 45° 脉宽（即 0.5 × 90° 时间）以及 TR 为 T 的 0.5 倍₁ （约1.5秒）。我们通常每个谱采集4次自由感应衰减信号（在VNMR软件中平均次数（na）= 4），以获得约6秒的时间分辨率。该时间分辨率足以准确测定静息和最大线粒体ATP生成速率。
3. 采集静息状态光谱约5分钟。
4. 通过将袖带充气至270-300 mmHg，持续10-12分钟，以诱导缺血。
5. 松开袖带，并采集5分钟的恢复期光谱。
6. 将探针从磁体上取下，并将小鼠从探针中取出。在适当条件下让小鼠从麻醉状态恢复。实验可在后续几天重复进行。最后一次光谱实验结束后，取出小鼠腿部肌肉并立即用液氮冷冻夹取₂ 用于通过高效液相色谱法分析ATP浓度。

数据分析

1. 数据使用多种核磁共振谱分析程序之一进行离线分析。本实验室通常采用标准拟合²和jMRUI（http://www.mrui.uab.es/mrui/mrui_Overview.shtml）来定量峰面积。
2. 缺血期间初始的磷酸肌酸（PCr）降解速率可反映正常氧条件下线粒体ATP生成能力，这一点已在多篇文献中有所描述^3-5。根据先前所述方法^4,6，PCr的恢复速率可用于确定线粒体ATP生成的最大能力。

图 1. 从磁体孔径前端观察的活体 MRI 装置示意图。该装置包括射频线圈、动物加热系统（或称温水循环系统）和梯度插入器。所有这些组件均插入水平磁体中。温水在磁体室外的水箱中加热后，通过特氟龙管（绿色胶带标记）导入动物加热系统。水在圆筒中循环后，被抽回水箱重新加热。在 MRI 实验期间，通过异氟烷管和真空管对小鼠进行麻醉。
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图2. 一只背部携带异种移植肿瘤（D282肿瘤）的裸鼠（箭头所示）的活体成像结果，显示不同的弛豫效应：A. T₁加权图像（TR/TE=500/14.2 ms）。B. T₂加权图像（TR/TE=2 s/40 ms）。T₁和T₂加权图像均采用自旋回波序列获取。C. 利用4组不同回波时间（TE）下采集的图像（TE值范围为20至80 ms）生成的T₂图。D. 采用梯度回波序列获取的T₂*加权图像（TR/TE=180/7.39 ms，翻转角=20度）。所有磁共振图像的视野均为35 × 35 mm²。
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图3. 小鼠置于水平体位固定装置中，腿部固定于射频线圈内的示意图。
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图 4. 经历一次缺血-再灌注循环过程中的活体³¹P 谱图。数据采集使用 7 T 垂直孔径磁体，并采用 20 Hz 指数滤波进行谱线展宽处理。TR=1，na=4，每 20 次谱图绘制一次。
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表1. 小鼠磁共振成像/磁共振波谱麻醉剂剂量。

动物 物种	麻醉剂 药物	剂量 （注射剂以 mg/kg 计）	给药途径
小鼠	Isoflurane 气体	4.0% 持续 2-3 分钟（诱导），随后 1.2 至 1.5% 持续吸入（维持）	通过鼻罩吸入
小鼠	Avertin	5%，10 ml/kg 体重	腹腔注射（IP）
小鼠	Ketamine/Xylazine	100 mg/kg 和 10 mg/kg	腹腔注射（IP）

表2. 具有弛豫权重的图像

图像加权	TR（重复时间）	TE（回波时间）
T1	短（短于T1）	短（短于T2）
T2	长（T1的3 ~ 5倍）	长（接近T2）
PD（质子密度）	长（T1的3 ~ 5倍）	短（短于T2）

T1：自旋晶格弛豫（或纵向弛豫）时间
T2：自旋-自旋弛豫（或横向弛豫）时间

讨论

调谐/匹配和匀场等采集前步骤对于获得高空间分辨率和高信噪比（SNR）至关重要。在信号采集过程中，使用动物监测系统监控动物状态也非常重要，以维持动物稳定的生理状态，符合人道动物操作规范，并防止可能出现的伪影测量结果。本方案中所述的操作步骤可进行修改，以获取更多额外信息，包括扩散、灌注和血流成像以及体内的局部波谱分析。除非特定操作需要附加装置，所有动物准备步骤均应保持一致。本研究中描述的磁共振成像（MRI）和磁共振波谱（MRS）方案已应用于多个研究领域，包括用于开发靶向肿瘤的纳米探针的纵向MRI研究⁷，以及线粒体ATP生成的MRS研究^5,8。MRI和MRS是无创观察动物解剖结构、弛豫变化或非破坏性监测代谢过程的有用技术。这两种技术均可作为纵向监测手段，用于随时间观察上述变化。针对MRS，我们设计了一种定制的射频探头，使动物可在垂直孔径磁体中保持水平位置。因此，这些实验可在任何垂直宽孔径磁体上进行，例如大多数化学系所配备的设备。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Inova 200 MR 扫描仪/4.7 T	Varian Inc., Agilent		用于小鼠 MRI
Inova 300 NMR 波谱仪/7 T	Varian Inc., Agilent		用于小鼠骨骼肌的 MRS