无脊椎动物表现出一种类似于脊椎动物的自主性交感样反应。通过心血管系统与呼吸系统的协调，可以测量出用于评估生物体内部状态的生物学指标。
本文内容
摘要
摘要
恐惧、逃跑或战斗反应是研究生物体在面临捕食者攻击时对其环境感知能力的基本生理基础。尽管目前尚不清楚无脊椎动物是否具有与脊椎动物完全相同的自主神经系统，但已有证据表明，无脊椎动物具备类似交感神经的反应机制，用于调节内部环境，并使机体为应对特定刺激而做好行为准备。此外，这种生理反应可以被有效测量，并可作为反映动物内部状态的生物学指标。通过对中枢神经系统调控下心血管系统与呼吸系统协调活动的变化进行测量，可将生理反应的变化直接关联到内、外部应激源。更具体而言，监测心率和呼吸频率能够提供可量化的应激反应指标，而这些指标并不总是能通过行为观察获得。由于记录技术的可行性，以及自1888年赫胥黎以来对螯虾形态学的深入研究和其典型行为的广泛了解，螯虾是进行心率和呼吸频率测量的理想模式生物。
方案
引言
生物体必须表现出多种行为，以应对威胁性刺激和环境变化。在脊椎动物中，自主反应已被广泛研究，表现为“战斗或逃跑”反应，即交感神经系统在生理上为内部环境做好准备（Carpenter，1976；Nicholls et al., 2001）。生物体通过生理变化来调节应激反应，并改变行为以应对即将发生的攻击或环境变化。研究表明，心血管系统与呼吸系统紧密相连，从而使内部环境能够响应并实施相应反应。众所周知，呼吸系统和心血管系统的自主调控能够调节特定靶组织在即将发生的行为反应中所需的氧气供应和营养物质。
在脊椎动物中，自主性与生理反应已高度进化；因此，复杂无脊椎动物很可能也具有类似的发达反应系统（Schapker et al., 2002；Zavarzin, 1941）。尽管脊椎动物与无脊椎动物在系统分类上差异显著，但高度进化的无脊椎动物仍需要快速的心血管和呼吸反应，以应对“战斗或逃跑”类的行为需求。对于许多无脊椎动物而言，类似“交感样”的生理反应是可以被量化的。早在1927年，许多早期研究便已在无脊椎动物中开展，尤其是广泛采用节肢动物作为研究对象（Alexandrowicz, 1932；Orlov, 1927；Zavarzin, 1941）。
小龙虾已知会表现出多种快速行为，并具有评估和响应环境刺激的能力。早期研究已注意到一种类似交感神经的反应，即在受到威胁时立即迅速采取防御姿态（Bethe, 1897；Huxley, 1880；Shuranova et al., 2006；Wiersma, 1961）。成年小龙虾的心脏具有神经源性，其心跳和节律由中枢神经系统控制（Alexandrowicz, 1932；Yamagishi 和 Hirose, 1997；Yamagishi et al., 1997；Wilkens, 1999）。通常情况下，动物心率（HR）的测量可直接反映其内部环境的兴奋性和应激准备状态。在小龙虾中，当遭遇感知到的威胁性刺激时，防御姿态伴随心率升高（Listerman et al., 2000）。类似类型的神经系统反应也在刺龙虾中被观察到（Yazawa 和 Katsuyama, 2001）。
呼吸系统也受到神经控制，其中呼吸中枢模式发生器（VPG）通过两个特化的附肢——鳃耙器的泵动作用，调控经鳃部的氧气摄取（Mendelson，1971）。每个鳃腔的前端各有一个鳃耙器，通过节律性运动将水流引过鳃部（Pasztor，1968）。与心脏类似，VPG的活动可受多种因素调节。先前在帝王蟹（Cancer magister）中的研究表明，心脏和呼吸节律可通过指令神经元的中枢控制而发生改变（Wilkens 等，1974）。此外，已知甲壳动物中VPG的活动会随着内部生理反应的变化以及社会互动或环境变化而发生改变（Burmistrov 和 Shuranova，1996；Cuadras，1979，1980；Li 等，2000；Listerman 等，2000；McMahon 和 Wilkens，1983；Schapker 等，2002；Shuranova 等，2002；Wilkens，1976）。如在螯虾中所观察到的，呼吸活动（VR）可随内部状态的不同而变化，且在遭遇意外外界刺激时可记录到VR的改变（Shuranova 等，1993；Shuranova 等，2002）。
由于心率（HR）和呼吸率（VR）测量具有可靠性和可行性，未来可提出的问题数不胜数。如前所述，已有研究致力于考察社会互动和环境干扰期间的自主神经反应。有趣的是，仍有许多领域有待探索，例如在机体自然激素变化和/或其他生理过程中自主神经反应的检测。未来可能的研究方向还包括交感神经样反应在交配行为及嗅觉化学感知期间的表现。尤为重要的是，与行为观察相比，生理反应可能更深入地揭示生物体对环境的响应，因为动物在内部准备就绪时并不总是表现出可观察的行为反应。因此，生理测量为评估生物体内部状态提供了一个生物学指标，有助于解释生物体整体上的变化。
方法
记录心电图（ECG）以测定心率和通气率的操作步骤
在开始为螯虾布线之前，需要先准备导线。剪取两根足够长的绝缘不锈钢导线（直径0.005英寸，带涂层时直径为0.008英寸；A-M Systems，Carlsburg，WA），使其能够插入螯虾体内并充分连接至阻抗检测仪（UFI，型号2991）。用火焰烧去将要插入头胸甲的导线末端约0.5 mm的绝缘层。注意不要去除过多绝缘层，因为动物体外的裸露导线必须重新包覆，以防止阻抗记录发生短路。然后使用镊子将烧过的导线末端弯成90度角，以便插入头胸甲。确保导线插入部分不要太长，以免损伤内部器官。为了便于将导线插入塑料管（用于保护导线），最好将两根导线松散地绞合在一起。如果需要同时记录心跳和呼吸频率，请重复上述步骤一次，并在将两组导线插入塑料管前将其松散地编织在一起。务必明确标记用于记录心跳和呼吸频率的导线，以免混淆各组导线所连接的阻抗检测仪。最好在开始时就对导线进行标记，或通过将其中一组导线剪短以作区分。
为了可行且安全地对小龙虾进行布线，最好用湿布或湿纸巾包裹其螯足和步足（背部和一侧保持暴露），以避免对操作者和/或小龙虾造成伤害（图1）。
图 1. 小龙虾螯足和步足的包裹方法。用湿润的纸巾包裹小龙虾可防止对操作者和小龙虾本身造成伤害。该包裹方式可限制小龙虾活动其螯足和步足的能力。
开始布线操作时，最好从鳃腔开始，因为每只小龙虾的头胸甲厚度各不相同，施加过大的力量可能损伤其内部器官；而从鳃腔开始操作可降低对动物造成致命压力的风险，相较于在胸腔区域操作更为安全。第一个孔洞使用尖头解剖刀制作，大小仅需足以将导线插入至鳃腔前部区域（即前鳃室，用于监测通气频率；Schapker et al., 2002）。若孔洞过大，会导致大量血淋巴流失且无法有效封闭，从而增加导线无法固定在指定孔洞中的可能性。导线就位后，立即在导线上滴加少量胶水（氰基丙烯酸酯）和加速剂（HobbyTown USA, Lexington, KY）。使用快干胶可减少动物因操作而产生的应激反应。需特别注意，仅可在甲壳表面施加极少量加速剂，因其对小龙虾具有毒性，可能导致死亡。如有任何多余的加速剂残留，应立即用纸巾擦拭干净。在鳃腔内放置第二根导线时，重复上述步骤。这两根导线应横跨颚舟片（呼吸器官），以确保在每次颚舟片运动过程中获得稳定且准确的阻抗测量结果（图2）。为获得准确的记录，务必确保第二根导线未置于鳃腔之外或进入胸腔区域。
图 2. 不锈钢丝在鳃腔内的放置位置。头胸甲上的白点表示不锈钢丝在表皮下插入的位置。钢丝跨越颚舟片，通过动态阻抗测量其运动。
将电极连接至胸腔内心脏的步骤与上述方法相同，只是将导线置于背甲下方，正对心脏位置，并沿头尾方向跨过心脏（图3）。这种放置方式可确保每次心脏收缩时获得强而准确的阻抗测量值（Listerman et al., 2001）。
图 3. 不锈钢丝在胸腔内的放置位置。甲壳上的白点表示不锈钢丝在表皮下插入的位置。钢丝以头尾方向横跨心脏。这将通过动态阻抗测量实现对心脏收缩的测定。
当四根导线均放置到位后，混合速干胶（Eastman，5分钟干燥环氧树脂），并涂抹于每个位置的孔洞及导线上。当导线和钻孔部位均被充分覆盖后，用剩余的环氧树脂将塑料管固定在螯虾背部。这可以确保在后续操作中导线不会从孔中被拉出。由于环氧树脂需要数分钟才能干燥，需将螯虾手持固定或置于无水容器中，直至环氧树脂表面不再发黏。待环氧树脂完全干燥后，用水清洗螯虾以去除残留化学物质，并将其重新放回水生环境中。为确保螯虾健康，最好在约一小时后更换水体，以清除任何尚未去除的化学残留物。正如先前研究者所指出，我们发现长时间操作会因应激影响螯虾的生理测量指标，该影响可持续24小时至3天（Wilkens et al., 1985）；因此，动物应在任何实验前静置2至3天。
记录心电图时，将螯虾的导线连接至阻抗检测器。跨心脏的两根导线（用于测量心率）应连接至同一个阻抗检测器，跨颚舟片的两根导线（用于测量呼吸率） likewise 连接至另一个阻抗检测器。阻抗检测器用于测量两根不锈钢导线之间的动态电阻。通过 PowerLab/4SP 接口（AD Instruments）将检测器在线连接至 PowerLab 以记录这些信号。所有事件均使用 PowerLab Chart 软件 5.5.6 版（AD Instruments，澳大利亚）进行测量和校准。开始时，设置采样速率为 4 kHz。较大的偏转代表心跳和呼吸频率。为便于计数每次心率/呼吸率，可对数据集应用平滑函数。若对 100 个数据点进行平滑（即取平均值），所得曲线将仅显示心跳波形。心率可通过在 10 秒时间间隔内直接计数每次心跳次数，再换算为每分钟心跳次数（BPM）来确定。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 手术刀 | 适用于3号刀柄的11号不锈钢外科刀片 | ||
| 不锈钢丝 | A-M Systems, Carlsburg, WA | 直径0.005英寸，带涂层后为0.008英寸 | |
| 阻抗检测仪 | UFI | 型号2991 | |
| 塑料管 | Cole-Parmer | Tygon管，内径0.0812，外径0.1492 | |
| 快干胶（氰基丙烯酸酯） | HobbyTown USA, Lexington, KY | ||
| 促进剂 | HobbyTown USA, Lexington, KY | ||
| 粘合剂 | Eastman | 5分钟固化环氧树脂 | |
| 通过PowerLab/4SP接口连接的PowerLab |  ADInstruments | ||
| PowerLab Chart | AD Instruments, Australia | 软件版本5.5.6 | |
| PowerLab Chart | AD Instruments, Australia | 软件版本3.5.6 |
参考文献
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