在本视频文章中，我们介绍了一种利用快速磁珠辅助细胞分选策略分离和纯化Drosophila外周神经元的方法。从分离细胞中获得的RNA可直接用于包括微阵列分析在内的下游应用。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
TheDrosophila周围神经系统（PNS）是研究神经元发育和树突形态发生复杂过程在功能和分子水平上的有力模型。为了辅助这些分析，我们开发了一种分离PNS神经元亚类的策略，这类神经元被称为树突分支（da）神经元，已被广泛用于研究树突形态发生1,2这些神经元极难分离为纯细胞群体，部分原因在于其数量极为稀少，且位于坚韧的几丁质幼虫表皮下方，难以触及。我们新开发的方法克服了这些挑战，基于使用抗体包被的磁珠进行快速且特异性的细胞富集。在磁珠分选研究中，我们采用了表达小鼠CD8标记的GFP融合蛋白的同龄三龄幼虫，UAS-mCD8-GFP)3在 IV 类树突状分支（da）神经元特异性调控下pickpocket (ppk)-GAL4driver4或用于控制 pan-da 神经元特异性 GAL421-7driver5. 尽管本实验方案已针对分离附着于幼虫角质层内壁的外周神经系统细胞进行了优化，但通过调整若干参数，该方案也可用于分离在幼虫或蛹期发育阶段附着于角质层的多种不同类型细胞（例如上皮细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等），或根据GAL4特异性驱动表达模式，从幼虫器官中分离其他类型的细胞。采用此方法提取的RNA质量较高，可直接用于后续基因组学分析，例如微阵列基因表达谱研究。该方法为开展分离细胞的相关研究提供了一种强大的新工具Drosophila树突分支（da）神经元，从而为树突形态发生的分子机制提供了新的见解。
方案
磁珠分选的一般说明 果蝇 外周神经元（完成本方案所需的总时间：2.5–3 小时）
必须始终遵守标准的实验室操作规程，以维持清洁且无RNA酶的环境，防止RNA降解。
当解剖 Drosophila 幼虫表皮并将其置于细胞解离缓冲液中时，外周神经元是最后从表皮上脱落的细胞之一。我们利用这一特性设计了本实验方案，旨在分离多树突神经元之前，先去除表皮上大多数非特异性细胞（如肌肉和脂肪细胞）。
经过练习，整个实验方案可在约2.5小时内成功完成。抗体包被磁珠的制备必须在实验开始前完成。
1. 准备磁珠以结合细胞：
此步骤必须在实验开始前完成。制备好的珠子可保存在4°C，直至需要时使用。
- 用 PBS 清洗 100 μl Dynabeads M-280 Streptavidin 包被的磁珠三次：每次加入 500 μl 新鲜 PBS 重悬磁珠，并在强磁场中沉淀磁珠。
- 最后将磁珠直接重悬于 100 μl 未稀释的生物素化大鼠抗小鼠 CD8a 抗体中（抗体浓度为 100 μg/ml）。
- 将混合物置于冰上孵育 1 小时，期间偶尔轻轻涡旋以防止沉淀。[1 μl Dynabeads....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本方案经过优化，可用于分离和纯化紧密附着于黑腹果蝇三龄幼虫表皮内表面的外周神经元，采用磁珠细胞分选策略。尽管我们已使用该方案特异性分离黑腹果蝇的da神经元，但通过调整若干参数并使用标记特定细胞类型的特异性GAL4,UAS-mCD8-GFP报告转基因品系，该方案也可适用于分离在幼虫或蛹期发育阶段中附着于表皮的其他细胞类型（例如上皮细胞、肌肉细胞、其他外周神经元）。此外，该方案可应用于功能缺失和功能获得的研究策略中，将目标基因克隆至UAS-mCD8-GFP转基因载体，并与GAL4转基因品系组合，从而在特定细胞类型中实现基因特异性的功能缺失（例如UAS-RNAi）或功能获得。例如，在研究转录因子时，可借助该方法鉴定在特定细胞类型中发生功能缺失或功能获得表达后可能上调或下调的靶基因。通过本方案从纯化的目标细胞类型中提取总RNA，并利用该RNA进行微阵列表达谱分析，即可鉴定出差异表达的基因，这些基因可能作为转录调控的下游靶点，在介导细胞内表型变化过程中发挥重要作用。
为了成功进行细胞分选，必须仔细关注上述方案中强调的关.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
感谢 Yuh-Nung Jan 博士和 Wes Grueber 博士提供本研究中使用的果蝇品系。作者感谢 Thomas F. 和 Kate Miller Jeffress 纪念信托基金对本研究的支持（D.N.C.），以及乔治梅森大学教务长办公室（E.P.R.I.）的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS） | MP Biomedicals | PBS10X02 | 稀释至1X工作液 |
| 10X Liberase Blendzyme 3 | 罗氏集团 | 11814176001 | 稀释至1X工作液（28 Wünsch 单位/瓶 |
| RNase-AWAY | Sigma-Aldrich | 83931 | |
| 生物素标记的大鼠抗小鼠 CD8a 抗体 | Invitrogen | MCD0815 | 100 μg/ml 储存液浓度 |
| BSA（牛血清白蛋白），第五组分 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 11018-017 | 在 PBS 中配制 1% BSA 溶液 |
| Dynabeads M-280 链霉亲和素 | Invitrogen | 11205D | 1 μl 可结合 0.05–0.10 μ生物素化抗体的克数 |
| PicoPure RNA 提取试剂盒 | Molecular Devices | KIT0204 | 遵循制造商说明’s 指令 |
仪器设备
|
参考文献
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling o....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
