在本视频文章中，我们介绍了一种利用快速磁珠辅助细胞分选策略分离和纯化Drosophila外周神经元的方法。从分离细胞中获得的RNA可直接用于包括微阵列分析在内的下游应用。
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摘要
摘要
TheDrosophila周围神经系统（PNS）是研究神经元发育和树突形态发生复杂过程在功能和分子水平上的有力模型。为了辅助这些分析，我们开发了一种分离PNS神经元亚类的策略，这类神经元被称为树突分支（da）神经元，已被广泛用于研究树突形态发生1,2这些神经元极难分离为纯细胞群体，部分原因在于其数量极为稀少，且位于坚韧的几丁质幼虫表皮下方，难以触及。我们新开发的方法克服了这些挑战，基于使用抗体包被的磁珠进行快速且特异性的细胞富集。在磁珠分选研究中，我们采用了表达小鼠CD8标记的GFP融合蛋白的同龄三龄幼虫，UAS-mCD8-GFP)3在 IV 类树突状分支（da）神经元特异性调控下pickpocket (ppk)-GAL4driver4或用于控制 pan-da 神经元特异性 GAL421-7driver5. 尽管本实验方案已针对分离附着于幼虫角质层内壁的外周神经系统细胞进行了优化，但通过调整若干参数，该方案也可用于分离在幼虫或蛹期发育阶段附着于角质层的多种不同类型细胞（例如上皮细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等），或根据GAL4特异性驱动表达模式，从幼虫器官中分离其他类型的细胞。采用此方法提取的RNA质量较高，可直接用于后续基因组学分析，例如微阵列基因表达谱研究。该方法为开展分离细胞的相关研究提供了一种强大的新工具Drosophila树突分支（da）神经元，从而为树突形态发生的分子机制提供了新的见解。
方案
磁珠分选的一般说明 果蝇 外周神经元（完成本方案所需的总时间：2.5–3 小时）
必须始终遵守标准的实验室操作规程，以维持清洁且无RNA酶的环境，防止RNA降解。
当解剖 Drosophila 幼虫表皮并将其置于细胞解离缓冲液中时，外周神经元是最后从表皮上脱落的细胞之一。我们利用这一特性设计了本实验方案，旨在分离多树突神经元之前，先去除表皮上大多数非特异性细胞（如肌肉和脂肪细胞）。
经过练习，整个实验方案可在约2.5小时内成功完成。抗体包被磁珠的制备必须在实验开始前完成。
1. 准备磁珠以结合细胞：
此步骤必须在实验开始前完成。制备好的珠子可保存在4°C，直至需要时使用。
- 用 PBS 清洗 100 μl Dynabeads M-280 Streptavidin 包被的磁珠三次：每次加入 500 μl 新鲜 PBS 重悬磁珠，并在强磁场中沉淀磁珠。
- 最后将磁珠直接重悬于 100 μl 未稀释的生物素化大鼠抗小鼠 CD8a 抗体中（抗体浓度为 100 μg/ml）。
- 将混合物置于冰上孵育 1 小时，期间偶尔轻轻涡旋以防止沉淀。[1 μl Dynabeads M-280 可结合 0.05–0.10 μg 生物素化抗体]。
- 按步骤 1.1 所述方法清洗磁珠-抗体复合物三次，以去除未结合的抗体。此时磁珠已包被抗体，可直接使用。将磁珠-抗体复合物储存于 100 μl 1× PBS 中，4°C 保存至使用前。
2. 选择与清洗幼虫：（10-15 分钟）
- 选取30-50只年龄相匹配的三龄幼虫，放入含有1-1.2 ml 1×磷酸盐缓冲液（PBS）的1.6 ml微量离心管中。（3-5分钟）
- 盖紧管盖，以最大转速涡旋震荡三次，每次1秒。
- 使用火焰抛光的巴斯德移液管彻底弃去上清液。重复洗涤（2.1）和涡旋（2.2）步骤3-4次，直至上清液中无可见的食物颗粒和残渣。
- 用1 ml 70%乙醇短暂洗涤一次，弃去上清液。
- 用1 ml去离子水（ddH2O）洗涤幼虫两次，每次均弃去上清液。
- 用1 ml RNase-AWAY再次短暂洗涤一次，弃去上清液。
- 用1 ml去离子水（ddH2O）洗涤幼虫三次，以确保完全去除RNase-AWAY。
3. 解剖：（10-12 分钟）
- 将10-12条幼虫放置在涂有Sylgard的35 mm培养皿中央，使它们彼此略微分开。[关键步骤：丢弃任何看起来未处于适当发育阶段的幼虫]
- 使用一对精细解剖剪刀剪开所有幼虫的前端。
- 使用一对钝头Dumont 5号镊子将幼虫内外翻转。将一把镊子插入幼虫表皮内，一直伸至后端。夹紧镊子尖端以夹住表皮的后端（图1a）（可尝试将表皮压在Sylgard表面以使其更易操作）。用第二把镊子将幼虫表皮向内推，使其完全翻转。[关键步骤：在进行细胞分离实验前，建议先练习此方法数次。应尽量使幼虫完全翻转，以确保所有软组织均暴露于溶液中，便于后续解离。]
- 解剖完3-4条幼虫后，立即将其转移至装有新鲜冰上预冷PBS的1.6 ml微量离心管中（将管子置于冰上）。
- 重复步骤3.1至3.4，直至收集到所需数量的幼虫（本方案中为30-40条）。[关键步骤：预计在解剖和解离过程中会有10-20%的损失，请据此合理规划幼虫数量。]
4. 去除松散附着的非特异性细胞：（2-3 分钟）
[此步骤有助于清除松散附着的非特异性组织，如脂肪体和中枢神经系统组织。]
- 取含有倒置幼虫表皮的1.6 ml微量离心管，弃去上清液，加入约700–800 μl新鲜的预冷PBS。
- 以最大速度脉冲式涡旋振荡微量离心管5次（每次3秒）。
- 弃去上清液，加入约700–800 μl新鲜的预冷PBS。
- 重复步骤4.2和4.3共三次。
- 将幼虫表皮重悬于400 μl新鲜的预冷PBS中。
5. 将组织解离为单细胞悬液：（18–20 分钟）
[关键步骤：过度解离可能导致细胞表面标志物丢失，从而造成细胞得率低和细胞活力差。幼虫组织可通过机械解离（超声、研磨）、酶解解离（胰蛋白酶、胶原酶等）或两者结合的方式进行解离。由于这些幼虫组织较难解离，我们发现联合使用机械和酶解方法效果最佳。]
- 向悬浮于 400 μl PBS 中的幼虫表皮中加入 1.5 μl 的 1X Liberase Blendzyme 3（28 Wünsch 单位/瓶）。
- 在最大转速下涡旋振荡溶液 2–3 次，每次 1 秒（此操作应使松散附着在表皮上的细胞进入溶液中）。
- 在室温（22–25°C）下孵育溶液 5 分钟。[关键步骤：孵育时间显著影响最终的细胞分选效率。推荐的孵育时间应足以使组织松散。切勿超过 15 分钟。]
- 以最大转速对离心管进行脉冲式涡旋振荡，每次持续 2 秒，共 20–30 次。此操作应使肌肉及其他组织释放到溶液中。在每一步操作后，用荧光体视显微镜检查溶液中的少量样本。（随着经验积累，应能通过直接在荧光体视显微镜下观察微量离心管来判断解离程度）
- 用新鲜的冰预冷 PBS 清洗幼虫表皮 2–3 次，最后将其重悬于 500 μl 含 1% BSA 的新鲜冰预冷 PBS 中。
- 为防止幼虫表皮粘附于 2 ml Kontes 组织研磨器的玻璃表面及大间隙研杵上，先用含 1% BSA 的 PBS 溶液对组织研磨器和研杵进行预包被，短暂冲洗后弃去 BSA 溶液。随后，使用火焰抛光的巴斯德移液管，将第 5.5 步中的表皮转移至经 BSA 包被的组织研磨器中。[关键步骤：将组织研磨器/研杵置于冰上数分钟进行预冷却，以防止细胞损伤或裂解。]
- 以缓慢而稳定的手法进行 Dounce 匀浆，避免产生泡沫（约 20–30 次）。[关键步骤：必须缓慢且稳定地进行 Dounce 匀浆，否则可能导致细胞裂解。]
- 为评估细胞解离程度，用洁净的 Kimwipe 纸巾擦拭组织研磨器外壁，并在荧光体视显微镜下观察。神经元应已从表皮上脱离，并可在溶液中观察到。若此操作困难，可另取少量溶液用移液器吸出，在荧光体视显微镜下观察。细胞充分解离的良好标志是幼虫表皮上无神经元残留。然而，若仍观察到神经元附着于表皮，或存在未完全解离的细胞团块，应继续进行 Dounce 匀浆，直至获得单细胞悬液。
- 先用火焰抛光且尖端直径缩小至标准尖端约 50% 的巴斯德移液管将溶液吹打 5 次，再用尖端直径缩小至约 25% 的火焰抛光巴斯德移液管吹打 10 次。[关键步骤：剧烈吹打可能损伤细胞。应在各步骤之间监测细胞状态，并相应调整操作。]
- 将溶液通过 30 μm 细胞滤器过滤，并将滤过的细胞收集至 1.6 ml 微量离心管中。所得溶液应为单细胞悬液，现已可用于磁性细胞分选。
6. 磁珠细胞分选：（45 - 75 分钟，取决于抗体孵育时间）
- 向500 μl细胞悬液（步骤5.10）中加入15 μl抗体包被的磁珠。剩余的偶联抗体磁珠可保存至后续细胞分离时使用。
- 将细胞与抗体包被的磁珠在冰上孵育30–60分钟，期间偶尔手动混匀。[关键步骤： 在较高温度或更长时间下孵育可能导致抗体非特异性结合。]
- 将微量离心管置于强磁场中2分钟。所有被正向选择的细胞及未结合的磁珠将移至管壁一侧。
- 缓慢用移液器吸出上清液，注意不要扰动管壁上的细胞沉淀。
- 用新鲜的预冷PBS洗涤细胞3–4次，以去除任何残留的非特异性细胞。
- 将细胞重悬于30 μl新鲜的预冷PBS中。
- 为估算细胞纯度和得率，取5 μl细胞悬液滴加至血细胞计数板的抛光表面，在荧光体视显微镜下计数所有可见的荧光细胞。同时检查非荧光细胞的数量及任何杂质迹象。通常样本中荧光细胞的比例会非常高。
7. 从磁珠分选细胞中分离RNA：（60 – 75分钟）
- 计数后，将细胞置于磁场中离心形成沉淀，弃去上清液，并加入20 μl PicoPure™ RNA分离试剂盒（Molecular Devices）中的提取缓冲液。根据细胞数量，可能需要加入更大体积的提取缓冲液。
- 以最大速度涡旋振荡管子，使细胞沉淀与提取缓冲液充分混匀。
- 将管子在42°C孵育30分钟。
- 为确保在RNA柱纯化前去除磁珠（参见步骤7.5），将管子短暂离心（2,000 ×g，2分钟），使磁珠沉淀。然后将管子置于强磁场中以固定沉淀，将上清液转移至新的微量离心管中。
- 按照PicoPure RNA提取试剂盒制造商的说明进行RNA提取和柱纯化。DNA酶处理为可选步骤，可根据分析需求在RNA纯化过程中直接在柱上进行。最后，用少量洗脱缓冲液（11–30 μl）洗脱结合的总RNA，并于-80°C保存直至使用。如需评估总RNA质量，可取1 μl样品在Bioanalyzer 2100（Agilent Technologies, Inc.）上进行检测。
代表性结果：
采用磁珠分选法分离 Drosophila 多极化感觉神经元（da神经元）（图1）。从这些分离的da神经元中提取的RNA（图2a）质量优良，经安捷伦2100生物分析仪（Agilent Technologies, Inc.）检测，可见清晰的5.8S、18S和28S核糖体RNA峰（图2b）。以30-40只三龄幼虫为起始材料，使用ppk-GAL4驱动子平均可分离得到300-500个IV类da神经元，而使用泛da神经元特异性驱动子GAL421-7则可分离得到1500-2000个da神经元（包括I、II、III和IV类）。为评估所分离细胞的神经元特异性富集程度，我们采用定量反转录PCR（qRT-PCR）检测了两个神经元特异性基因标记物（elav和futsch）的表达。分析结果显示，与流程通过组（flow through）相比，这两个标记基因均呈现显著的倍数富集，表明按照本实验方案可实现da神经元的高度特异性富集（图3）。最后，利用从泛da神经元和IV类da神经元中分离得到的RNA，在安捷伦Drosophila melanogaster全基因组寡核苷酸微阵列（4 x 44K）上进行了转录表达谱分析（图4）。该分析不仅鉴定出多个先前已被证实参与da神经元树突形态发生的调控因子，还发现了一系列此前未被表征的分子及潜在的信号转导通路，这些分子可能在da神经元发育过程中发挥重要的功能作用。目前，针对这些尚未明确功能的分子在da神经元发育、特别是树突形态发生中潜在作用的研究正在进行中。
图1： Drosophila da神经元的磁珠分选示意图。 (a) 取携带da神经元特异性GAL4,UAS-mCD8-GFP报告转基因且年龄匹配的三龄幼虫，将其幼虫表皮内外翻转后解剖，以暴露外周神经系统（PNS）并置于解离缓冲液中，随后保存在冰上预冷的PBS中。 (b) 通过向含有幼虫表皮的溶液中加入Liberase Blendzyme 3进行酶解消化。 (c) 进一步通过涡旋振荡、吹打和Dounce匀浆相结合的方式对幼虫组织进行解离，以去除非特异性标记的组织，如脂肪体、肠道和中枢神经系统（CNS）。 (d,e) 使用30 μm细胞滤网对细胞进行过滤。所得溶液包含上皮细胞、肌肉细胞和神经元等多种细胞类型的单细胞悬液。 (f) 向细胞悬液中加入包被有抗小鼠CD8a抗体的Dynabeads M-280磁珠，并在冰上孵育30–60分钟。 (g) 磁珠与表达小鼠CD8标签GFP融合蛋白的da神经元结合。 (h,i) 将溶液置于强磁场中，分离带有磁珠的细胞。弃去上清液，并对细胞洗涤三次，以去除任何残留的非特异性细胞，最终获得(j) 高度纯化的da神经元群体。请点击此处查看图1的放大版本。
图2: (a) 通过细胞解离和磁珠分选获得的GFP荧光标记的IV类da神经元阳性筛选代表性图像。结果显示，所获得的神经元群体中IV类da神经元高度富集，几乎不含或仅有极少的污染细胞杂质。(b) 使用安捷伦2100生物分析仪（Agilent Technologies, Inc.）对磁珠分选后的da神经元提取的总RNA进行电泳分析，图中显示了高质量的总RNA，表现为5.8S、18S和28S rRNA条带清晰可见。请点击此处查看图2的放大版本。
图 3：对分离的 da 神经元（GAL421-7,UAS-mCD8-GFP）及流穿组分中神经元标志物基因表达进行 qRT–PCR 分析，实验重复三次。通过 qRT–PCR 检测两种神经元特异性标志基因（elav 和 futsch）的表达水平。分析所得数据以内源性对照（rp49）归一化，并采用 ΔΔCτ 法6计算相对于流穿组分的相对表达水平。与流穿组分相比，分离的 da 神经元群体中 elav 和 futsch 均显著富集。
图4： 典型的IV类da神经元特异性Cy3标记的微阵列图像文件。图中显示的是安捷伦（Agilent）黑腹果蝇全基因组寡核苷酸微阵列（4 x 44K），该阵列与通过磁珠分选纯化的IV类da神经元中提取的Cy3标记总RNA进行杂交。请点击此处查看图4的放大版本。
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讨论
本方案经过优化，可用于分离和纯化紧密附着于黑腹果蝇三龄幼虫表皮内表面的外周神经元，采用磁珠细胞分选策略。尽管我们已使用该方案特异性分离黑腹果蝇的da神经元，但通过调整若干参数并使用标记特定细胞类型的特异性GAL4,UAS-mCD8-GFP报告转基因品系，该方案也可适用于分离在幼虫或蛹期发育阶段中附着于表皮的其他细胞类型（例如上皮细胞、肌肉细胞、其他外周神经元）。此外，该方案可应用于功能缺失和功能获得的研究策略中，将目标基因克隆至UAS-mCD8-GFP转基因载体，并与GAL4转基因品系组合，从而在特定细胞类型中实现基因特异性的功能缺失（例如UAS-RNAi）或功能获得。例如，在研究转录因子时，可借助该方法鉴定在特定细胞类型中发生功能缺失或功能获得表达后可能上调或下调的靶基因。通过本方案从纯化的目标细胞类型中提取总RNA，并利用该RNA进行微阵列表达谱分析，即可鉴定出差异表达的基因，这些基因可能作为转录调控的下游靶点，在介导细胞内表型变化过程中发挥重要作用。
为了成功进行细胞分选，必须仔细关注上述方案中强调的关...
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致谢
感谢 Yuh-Nung Jan 博士和 Wes Grueber 博士提供本研究中使用的果蝇品系。作者感谢 Thomas F. 和 Kate Miller Jeffress 纪念信托基金对本研究的支持（D.N.C.），以及乔治梅森大学教务长办公室（E.P.R.I.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS） | MP Biomedicals | PBS10X02 | 稀释至1X工作液 |
| 10X Liberase Blendzyme 3 | 罗氏集团 | 11814176001 | 稀释至1X工作液（28 Wünsch 单位/瓶 |
| RNase-AWAY | Sigma-Aldrich | 83931 | |
| 生物素标记的大鼠抗小鼠 CD8a 抗体 | Invitrogen | MCD0815 | 100 μg/ml 储存液浓度 |
| BSA（牛血清白蛋白），第五组分 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 11018-017 | 在 PBS 中配制 1% BSA 溶液 |
| Dynabeads M-280 链霉亲和素 | Invitrogen | 11205D | 1 μl 可结合 0.05–0.10 μ生物素化抗体的克数 |
| PicoPure RNA 提取试剂盒 | Molecular Devices | KIT0204 | 遵循制造商说明’s 指令 |
仪器设备
|
参考文献
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods. Methods. 25, 402-408 (2001).
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