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1:渗透避免检测。
- 检测前约16-24小时，挑到一个新的NGM板含有OP50 大肠杆菌 L4各基因型的幼虫阶段动物大肠杆菌 andincubate在20 ° C第二天，开始实验青壮年。
- 建议开展"盲目"的检测。每个被检测的应变板应relabelled第二个实验者，使用的实验已经完成时，将东窗事发relabelled板进行检测。
- 检测的一天，准备与4M原液的果糖，1％的刚果红溶液在室温下完全溶解。我们建议检查的解决方案之前，每个检测以来，染料可能随着时间的沉淀。
- NGM板的环形圈（直径为1厘米的）概述了固体培养基的中心，红色4M果糖溶液与15μL。让果糖溶液浸泡成的琼脂，这通常需要2至5分钟。
- 广场内的每个环的应变个人年轻的成年动物，并在随后的10分钟，以确定渗透屏障的响应。避免了环比在连续的6倍多的动物被列为正常;尝试在不到半年的退出环被认为是在渗透压的敏感性缺陷。
注意 :必须在每个检测控制应变。 N2年轻的成年动物作为阳性对照，因为他们果断地避免环屏障。已饿死，通过的dauer幼虫或过于干燥的板未来的动物，不应该使用。在开始的时候，控制动物应重复进行评估，以确认检测板和解决方案是正确的。
2:产生击倒蠕虫通过RNAi喂养。
- RNAi的板块:NGM的RNA干扰喂养板每公升含有17克琼脂，2.5克蛋白胨，1毫升5毫克毫升-1胆固醇3.0 g氯化钠;填补烧瓶与H 2 O和高压灭菌器，以1公升。后琼脂冷却到约65℃，加入25毫升1个M KPO 4，pH值6.0，1毫升的1 M 氯化钙 ，1毫升1M硫酸镁4，0,5毫升羧（50毫克毫升-1）和1毫升1M IPTG的。如果您正在准备扎实NGM开始，由微波熔化固体培养基，随后放置在板凳上冷却，然后添加如前所述，羧KPO 4，pH值6.0， 氯化钙 ， 硫酸镁和IPTG液体NGM。
每60毫米的培养皿中加入10毫升NGM。允许冷却，并保持在室温下过夜，使用前翻转板。板可以储存在4 ° C，约4-5天，在一个塑料袋。 - 细菌的制备及诱导: 大肠杆菌 HT115（DE3）菌株分离的殖民地，L4440包含一个相应的靶基因片段的载体转化到卢里亚Bertani（LB）琼脂平板（17克琼脂，蛋白胨10克，5克，酵母提取物，每公升10克氯化钠）含有氨苄青霉素（50微克/毫升）和四环素（15微克/毫升）。
选择一个细菌菌落和50μg/ mL氨苄青霉素的LB接种，并成长为6 8 H晃动在37 ° C，种子上的准备NGM板这种文化的下降，并彻底晾干后方可被孵化过夜板（ 12月24日H）在室温下，让细菌的生长，并开始上岗。在黑暗中孵化，因为四环素对光敏感，可能会影响板之间的RNAi实验的可变性。
它是需要使用一个积极的和一个用于RNAi喂养实验阴性对照。阳性对照是大肠杆菌 HT115细胞转化与L4440包含UNC - 22的基因序列的载体。 UNC - 22基因敲除产生"抽搐表型"。阴性对照与L4440空载体转化的大肠杆菌HT115细胞。 - L4从接种到NGM板OP50无细菌，并培育与20 NGM板阶段蠕虫蠕虫的处理和计分:第一天，地点° 12小时C（空腹）。
第二天，转移到与特定目标基因的RNAi表达的细菌seedded板年轻的禁食成人雌雄同体。保留40-48小时，在20 ° C至产生F1子代。
到与相同的细菌接种另一盘，然后把几个F1成虫。 24-48小时后，选择和隔离从F2代，年轻的成年人（完全形成突起外阴几个鸡蛋）和表型的得分。
注 :在神经细胞的RNAi诱导有一定的局限性，因为在C线虫的神经系统难治性属性的 RNAi。为了克服这种低效率的问题，在神经元，它是推荐使用的RRF - 3 株神经元10，过敏背景的RNAi的影响。在我们的实验没有differencES之间的布里斯托尔N2和RRF - 3株被发现的基因和表型分析。
3:使用菌株。
c. 在在这项工作中使用的线虫株见表1。突变株，越过对N2的野生 -至少四次，以去除不受欢迎的可能已在诱变协议产生的随机突变类型。
OP50 发送菌株 suppliied 线虫遗传中心，美国明尼苏达大学，HT115（DE3） 大肠杆菌质粒携带NRX - 1 pL4440（JA:C29A12.5）和NLG - 1（JA:C40C9.5彼得Askjaer博士，炫酷Andaluz Biología DEL Desarrollo（公共天线），中船重工大学巴勃罗Olavide，塞维利亚，西班牙）的基因片段。
4:代表结果。
说明性的结果表示在图1和2。十大动物，每一株和最低的三个副本实验进行。
图1。实验渗透避税行为。
对照菌株和NRX - 1（ok1649和tm1961）V缺乏mutantworms回应向后倒车时，他们遇到一个渗透屏障（4M果糖）。NLG - 1（ok259和tm474）X突变体无法检测到这一障碍。在缺乏NLG - 1和NRX - 1菌株CRR21（ok259 ok1649）VX和CRR23（tm1961; ok259）;双突变体VX恢复野生型表型。 *表示由T -学生测试的显着性差异（P≤0.001），在每个应变的响应布里斯托尔N2的野生型，T -学生的考试
图2。实验通过RNAi喂养击倒蠕虫。
HT115（DE3） 大肠杆菌转化空pL4440载体或含有相应的目标NRX - 1或NLG - 1被用来喂不同的蠕虫病毒株的基因片段。 *表示T -学生的考试空pL4440载体美联储的N2应变比较pL4440载体携带一个目标NLG - 1基因片段的细菌美联储的N2应变响应的显着性差异（P≤0.001 ）， 。