从小鼠胚胎干细胞中衍生造血干细胞

摘要

本方案详细描述了从小鼠胚胎干细胞（ESC）中获得可移植的造血干细胞，并将其注射到致死剂量辐照的受体小鼠中的过程。简言之，ESC 被诱导形成拟胚体并进行分化，随后用逆转录病毒 HoxB4 感染，并与 OP9 基质细胞及造血细胞因子共培养。

摘要

干细胞是指具有自我更新能力并能产生多种分化后代细胞的细胞。胚胎干细胞（ESC）来源于早期胚胎的胚泡，具有多能性分化潜能。由于其强大的分化潜力，胚胎干细胞已成为众多研究的焦点，旨在探索如何诱导其生成具有临床应用价值的细胞类型。最近，从小鼠胚胎干细胞成功衍生出造血干细胞（HSC）的技术已实现，本视频方案将展示该过程。HSC是目前临床上应用最广泛的细胞群体，用于治疗多种造血系统恶性肿瘤和疾病。然而，许多可能从HSC治疗中受益的患者无法获得合适的供体。胚胎干细胞可能为这些患者提供一种替代性的HSC来源。以下实验方案建立了一个基础研究体系，可用于研究ESC来源的HSC，并为从人胚胎干细胞中分离HSC提供参考。在本方案中，胚胎干细胞在 commercially available serum（经预先筛选适用于最佳造血分化的商品化血清）中以拟胚体（EB）形式进行为期6天的分化。随后将EB解离，并用逆转录病毒HoxB4进行感染。感染后的EB来源细胞被接种于OP9基质细胞上共培养，OP9基质细胞系源自M-CSF-/-小鼠颅骨的骨髓基质细胞，在含有促进造血的细胞因子的培养体系中共同培养十天。在此共培养过程中，被感染的细胞大量扩增，最终生成数亿个异质性细胞的混合群体。这些细胞可用于挽救并重建致死剂量辐照小鼠的造血系统。

方案

胚胎干细胞的分化

1. 使用ESC胰蛋白酶处理，收集接近汇合的胚胎干细胞（ESC）培养瓶中的细胞。
2. 将细胞重悬于5 mL分化培养基中，转移至未经明胶包被的T25培养瓶，于37°C孵育45分钟。收集上清液，并通过离心收集细胞。
   
   注意：来自ESC培养的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）会迅速贴附于未经明胶包被的T25培养瓶表面，因此在此贴壁步骤中可被去除。如果您未在MEFs上培养ESC，则可跳过此预贴壁步骤。
   
   
3. 将去除MEFs后的ESC用分化培养基重悬至333,333个细胞/50 mL的浓度。此浓度相当于每15 µL含有100个ESC。
4. 使用多通道移液器，将ESC以每15 µL液滴含100个细胞的密度接种至15 cm²培养皿中。使用8通道移液器时，每块培养皿可接种约18–22排液滴（每皿约5 mL）。
   
   注意：本方案中，2–5个15 cm²培养皿的悬滴量已足够，预计可获得2–5 × 10⁶个第6天的EB来源细胞。
   
   
5. 轻柔翻转培养皿使液滴倒置，于37°C、5% CO₂条件下孵育48小时。
6. 通过轻柔旋转培养皿合并液滴，并转移至15 mL锥形管中。用4–6 mL PBS冲洗培养皿，冲洗液一并加入同一15 mL锥形管。
   

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C57Bl/6 Rag-2/gamma-c 缺陷型小鼠	动物	Taconic Farm
平板摇床	工具	VWR international	33998-360	Ikaworks 品牌的轨道摇床
多通道移液器	工具	VWR international	15000-174	BioHit ePet
ES 胰蛋白酶	试剂	Invitrogen	15090-046	含 0.25% 胰蛋白酶的 PBS
标准胰蛋白酶	试剂	Invitrogen	25300-062	含 0.05% 胰蛋白酶-EDTA
PBS	缓冲液	Invitrogen	20012-027
无酶解离缓冲液	缓冲液	Invitrogen	13151-014
解离酶混合液	缓冲液	Invitrogen	17104-019	500 mg IV 型胶原酶
透明质酸酶	试剂	Sigma-Aldrich	H2126	分装为 500 μL 每份冷冻保存，避免反复冻融
DNase	试剂	Sigma-Aldrich	D4527
DMEM		Invitrogen	10-017CV
硫酸鱼精蛋白	试剂	Sigma-Aldrich	P3369	8 μg/mL
EB 分化培养基	培养基			请参见附带的 Protocol.doc 文件中的配方
10% IMDM	培养基			请参见附带的 Protocol.doc 文件中的配方
10% IMDM+细胞因子	培养基			请参见附带的 Protocol.doc 文件中的配方
20% 抗 MEM				请参见附带的 Protocol.doc 文件中的配方