从小鼠胚胎干细胞中衍生造血干细胞

摘要

本方案详细描述了从小鼠胚胎干细胞（ESC）中获得可移植的造血干细胞，并将其注射到致死剂量辐照的受体小鼠中的过程。简言之，ESC 被诱导形成拟胚体并进行分化，随后用逆转录病毒 HoxB4 感染，并与 OP9 基质细胞及造血细胞因子共培养。

摘要

干细胞是指具有自我更新能力并能产生多种分化后代细胞的细胞。胚胎干细胞（ESC）来源于早期胚胎的胚泡，具有多能性分化潜能。由于其强大的分化潜力，胚胎干细胞已成为众多研究的焦点，旨在探索如何诱导其生成具有临床应用价值的细胞类型。最近，从小鼠胚胎干细胞成功衍生出造血干细胞（HSC）的技术已实现，本视频方案将展示该过程。HSC是目前临床上应用最广泛的细胞群体，用于治疗多种造血系统恶性肿瘤和疾病。然而，许多可能从HSC治疗中受益的患者无法获得合适的供体。胚胎干细胞可能为这些患者提供一种替代性的HSC来源。以下实验方案建立了一个基础研究体系，可用于研究ESC来源的HSC，并为从人胚胎干细胞中分离HSC提供参考。在本方案中，胚胎干细胞在 commercially available serum（经预先筛选适用于最佳造血分化的商品化血清）中以拟胚体（EB）形式进行为期6天的分化。随后将EB解离，并用逆转录病毒HoxB4进行感染。感染后的EB来源细胞被接种于OP9基质细胞上共培养，OP9基质细胞系源自M-CSF-/-小鼠颅骨的骨髓基质细胞，在含有促进造血的细胞因子的培养体系中共同培养十天。在此共培养过程中，被感染的细胞大量扩增，最终生成数亿个异质性细胞的混合群体。这些细胞可用于挽救并重建致死剂量辐照小鼠的造血系统。

方案

胚胎干细胞的分化

1. 使用ESC胰蛋白酶处理，收集接近汇合的胚胎干细胞（ESC）培养瓶中的细胞。
2. 将细胞重悬于5 mL分化培养基中，转移至未经明胶包被的T25培养瓶，于37°C孵育45分钟。收集上清液，并通过离心收集细胞。
   
   注意：来自ESC培养的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）会迅速贴附于未经明胶包被的T25培养瓶表面，因此在此贴壁步骤中可被去除。如果您未在MEFs上培养ESC，则可跳过此预贴壁步骤。
   
   
3. 将去除MEFs后的ESC用分化培养基重悬至333,333个细胞/50 mL的浓度。此浓度相当于每15 µL含有100个ESC。
4. 使用多通道移液器，将ESC以每15 µL液滴含100个细胞的密度接种至15 cm²培养皿中。使用8通道移液器时，每块培养皿可接种约18–22排液滴（每皿约5 mL）。
   
   注意：本方案中，2–5个15 cm²培养皿的悬滴量已足够，预计可获得2–5 × 10⁶个第6天的EB来源细胞。
   
   
5. 轻柔翻转培养皿使液滴倒置，于37°C、5% CO₂条件下孵育48小时。
6. 通过轻柔旋转培养皿合并液滴，并转移至15 mL锥形管中。用4–6 mL PBS冲洗培养皿，冲洗液一并加入同一15 mL锥形管。
   
   注意：最多可合并五个悬滴培养皿。EB在持续分化过程中会继续生长，若密度过高则易形成大团块。
   
   
7. 让合并后的EB依靠重力自然沉降（约10分钟），吸除上清液，注意勿扰动EB。轻柔地将EB重悬于10 mL分化培养基中，转移至10 cm非黏附性培养皿中。
8. 将培养皿置于摇床，以50 rpm振荡，于37°C、5% CO₂条件下继续孵育。
9. 24小时后（分化第4天），轻柔旋转培养皿使EB集中于皿底中央，小心更换50%培养基（5 mL），加入5 mL新鲜分化培养基。将培养皿放回培养箱继续孵育两天。

EB 解离及 MSCV-HoxB4-IRES-GFP 感染

1. 分化第六天，将拟胚体（EBs）转移至15 mL锥形管中，静置使其自然沉降。
2. 吸除培养基，加入10 mL PBS重悬，静置使EBs再次沉降，随后吸除PBS。
3. 加入250 µL解离酶混合液和1 mL PBS，于37°C水浴中孵育20分钟，期间偶尔轻柔旋转管子以混匀酶液与EBs。
4. 加入8 mL无酶解离缓冲液。
5. 使用5 mL移液器反复吹打混合物，直至EBs完全解离（约10次；过度吹打会增加EB来源细胞的死亡率）。
   1. 随着EBs解离，混合物将因细胞释放而变得浑浊。
   2. 吹打时将移液器枪头抵住锥形管底部，可产生剪切力，显著促进解离过程。
6. 通过离心收集细胞。
7. 将EB来源细胞重悬于5 mL含10%胎牛血清的IMDM培养基中，用台盼蓝染色法计数。
   
   注意：在分化第四天至第六天期间，EBs会发生空泡化，导致大量细胞凋亡和死亡。因此，在第六天时，多达30%的EB来源细胞可能被台盼蓝染色阳性。
   
   
8. 将EB来源细胞以每2 mL含100,000个细胞的比例重悬于10% IMDM培养基与病毒上清液的混合液中，使感染复数（MOI）达到5–10。加入硫酸鱼精蛋白至终浓度为8 µg/mL。
   
   注意：需准备足够的EB/病毒上清混合液，以接种四块6孔板（按每孔2 mL计算）。
   
   
9. 将2 mL EB/病毒上清混合液接种至已预先接种OP9基质细胞的四块6孔板中（见下文）。
10. 将培养板在室温下以2500 rpm离心90分钟，随后转移至37°C、5% CO₂培养箱中孵育。
11. 4–6小时后，收集各孔上清液，并通过离心收集可能仍悬浮的细胞。
12. 将离心所得沉淀（可能较小）重悬于48 mL含10%胎牛血清并添加细胞因子的IMDM培养基中。每孔加入2 mL重悬液，回置至原先进行感染并收集上清的四块6孔板中。
    
    注意：含细胞因子的10% IMDM培养基必须在使用前新鲜配制。
    
    
13. 将培养板置于37°C、5% CO₂条件下孵育七天。感染后第四天应可见克隆形成，第七天时克隆应较大且形态完整。正常扩增情况下，第七天每孔可获得40–60个克隆。
14. 感染后第七天，使用胰酶处理，收集并合并所有孔中的全部细胞（包括OP9基质细胞）。
    
    注意：在胰酶处理过程中使用的上清液或PBS洗涤液切勿丢弃。此时部分克隆可能仅轻微贴壁，且悬浮细胞较多。务必收集并合并所有洗涤液和上清液，以防丢失潜在有价值的细胞。
    
    
15. 将细胞重悬于8 mL新鲜的含细胞因子的10% IMDM培养基中，每2 mL分装至四个T75培养瓶中。每个培养瓶额外添加13 mL含细胞因子的10% IMDM培养基。在37°C、5% CO₂条件下继续孵育三天（即感染后第十天）。

 

OP9 基质细胞的培养与铺板

1. 按照标准操作规程在含20%胎牛血清的α-MEM培养基中培养OP9基质细胞。当OP9细胞生长至完全汇合时，其特性会发生改变。请始终在细胞达到80%汇合度时进行传代，传代比例不得超过1:3。
2. 在使用MSCV-HoxB4-IRES-GFP病毒感染第6天胚胎体来源细胞前24小时，将25,000个OP9细胞接种至4块6孔板的每孔中，培养基为含20%胎牛血清的α-MEM。

样品收集、分选与移植

1. 用胰蛋白酶处理在OP9基质上扩增10天的细胞，收集细胞并计数。
   
   注意：在胰蛋白酶处理过程中使用的上清液或PBS洗涤液切勿丢弃。此时培养物中部分集落可能仅轻微贴壁，且有大量细胞悬浮于培养基中。应收集并合并所有洗涤液和上清液，以确保不丢失任何潜在有价值的细胞。
   
   注意：良好的扩增应获得 40–50 × 10⁶ 细胞/原始6孔板感染，总计160-200 x 10⁶ 细胞
   
   
2. 此时可根据标准技术通过磁珠分选或流式细胞术对细胞进行分选。
3. 通过眶后静脉或尾静脉注射，将细胞移植至经分次照射（两次照射间隔2.5小时，每次4.625 Gy，总计9.25 Gy）的Rag-2/gc缺陷型受体小鼠（体重15–22克）。
   
   注意：照射时动物体重必须在15至22克之间。若动物体重超过22克，9.25 Gy的照射剂量将不足以实现适当的消融，细胞可能无法介导对致死性照射的挽救和/或植入造血系统。若移植较大动物，需通过实验确定合适的照射剂量。
   
   
4. 最低剂量为 2-5 x 10⁶ 细胞/动物需要确保能够从致死性辐射中被成功挽救。若对细胞进行分次注射，每次注入 2-5 x 10⁶ 细胞当量（例如 如果目标细胞群占未分选细胞池的10%，则注入2-5 × 10⁵ 细胞/动物
   
   注意：如果进行注射 >2 x 10⁶ 细胞，务必通过尾静脉注射，以避免眼眶内畸胎瘤的形成，因经眼眶后途径注射大量细胞可能导致此情况。
   
   
5. 维持 Rag-2^-/-/gc^-/- 在高压灭菌的笼具中饲养缺陷型受体小鼠。根据动物设施的“洁净程度”，移植后的小鼠在致死性照射后的5周内可能需要给予酸化水或甲氧苄啶-磺胺噁唑（Septra）。
   
6. 预期 >移植后3周外周血中90%的ES来源白细胞为GFP阳性。嵌合应为多谱系，尽管已知淋巴细胞会沉默逆转录病毒HoxB4-IRES-GFP。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C57Bl/6 Rag-2/gamma-c 缺陷型小鼠	动物	Taconic Farm
平板摇床	工具	VWR international	33998-360	Ikaworks 品牌的轨道摇床
多通道移液器	工具	VWR international	15000-174	BioHit ePet
ES 胰蛋白酶	试剂	Invitrogen	15090-046	含 0.25% 胰蛋白酶的 PBS
标准胰蛋白酶	试剂	Invitrogen	25300-062	含 0.05% 胰蛋白酶-EDTA
PBS	缓冲液	Invitrogen	20012-027
无酶解离缓冲液	缓冲液	Invitrogen	13151-014
解离酶混合液	缓冲液	Invitrogen	17104-019	500 mg IV 型胶原酶
透明质酸酶	试剂	Sigma-Aldrich	H2126	分装为 500 μL 每份冷冻保存，避免反复冻融
DNase	试剂	Sigma-Aldrich	D4527
DMEM		Invitrogen	10-017CV
硫酸鱼精蛋白	试剂	Sigma-Aldrich	P3369	8 μg/mL
EB 分化培养基	培养基			请参见附带的 Protocol.doc 文件中的配方
10% IMDM	培养基			请参见附带的 Protocol.doc 文件中的配方
10% IMDM+细胞因子	培养基			请参见附带的 Protocol.doc 文件中的配方
20% 抗 MEM				请参见附带的 Protocol.doc 文件中的配方