一种用于绘制人pre-mRNA上核糖核蛋白（RNPs）结合位点的快速高通量方法

摘要

由于前体mRNA具有瞬时性，因此难以分离和研究 体内. 此处，我们介绍一种新型的 体外 利用覆盖pre-mRNA选定区域的合成寡核苷酸文库研究RNA-蛋白质相互作用的方法

摘要

对与RNA结合蛋白共免疫沉淀（co-IP）的RNA进行测序，已通过证明结合位点位置常影响剪接因子功能的方式，加深了我们对剪接机制的理解。然而，与任何取样策略一样，识别出与剪接因子结合的RNA的概率与其细胞内丰度成正比。我们开发了一种新颖的体外方法，用于检测在原本瞬时存在的前体mRNA（pre-mRNA）上的结合特异性。该方法利用一种特别设计的寡核苷酸文库，覆盖内含子、外显子、剪接位点或其他pre-mRNA区域。该文库经过某种分子筛选过程。本文通过将寡核苷酸分离为结合与未结合组分，并采用双色芯片策略记录结合组分中每种寡核苷酸的富集情况，展示了该方法的应用。芯片数据可生成高分辨率图谱，能够识别核糖核蛋白（RNP）在pre-mRNA上结合的序列特异性和结构决定因素。该方法的一个独特优势在于，可避免当前免疫沉淀（IP）和SELEX技术中存在的、对mRNA丰度依赖的取样偏差，因为该寡核苷酸文库是依据pre-mRNA序列专门设计并合成的。寡核苷酸文库的灵活性是另一优势，实验者可根据研究需求自主选择目标区域并进行覆盖设计，从而定制化构建文库。利用该技术，可大规模检测多态性或突变对结合的影响，或将文库克隆至功能性剪接报告系统中，鉴定在包含组分中富集的寡核苷酸。这种新颖的体外高分辨率作图方案，为研究RNP与低丰度、瞬时存在的pre-mRNA分子之间的相互作用提供了独特途径，而此类分子因丰度极低，难以通过现有的体内技术进行有效研究。

方案

引物池设计与寡核苷酸回收

1. 第一步是设计要研究的前体 mRNA 池。可以使用 UCSC 基因组浏览器下载特定基因、剪接位点或其他感兴趣的区域来完成此步骤。
2. 选定感兴趣的区域后，使用以下条件在计算上对其进行平铺：读长应为 30 个核苷酸，重叠 10 个核苷酸，因此每个寡核苷酸相对于前一个移动 20 个核苷酸。*在剪接位点附近应增加寡核苷酸的重叠度以确保足够的覆盖度；将重叠从 10 个核苷酸增加到 20 个核苷酸即可实现这一点。
3. 在每个 30 核苷酸的寡核苷酸两端添加通用引物序列，用于后续扩增该寡核苷酸池。应将平铺的寡核苷酸序列订单提交给 Agilent，由其在定制的寡核苷酸微阵列上进行合成。
4. 从微阵列表面回收 DNA 寡核苷酸时，首先将阵列盖玻片放入杂交腔室中，并轻轻加入 500 μL 的 dH₂O 至玻片表面
5. 将阵列夹在盖玻片上方，注意避免产生气泡，以免干扰过程。务必使阵列朝下放置，使带有寡核苷酸的一侧接触水面。一个简便的判断方法是“Agilent 接触 Agilent”，即阵列上的 Agilent 标签与盖玻片上的 Agilent 标签相对
6. 封闭杂交腔室，并在杂交炉中于 99°C 旋转过夜
7. 次日，小心地从腔室中取出阵列并吸去液体，此时液体中已含有从阵列表面释放的寡核苷酸，即为寡核苷酸池
8. 将该寡核苷酸池转移至 1.5 mL Eppendorf 管中，并以 50% ....

讨论

进行此操作时，重要的是要记住，文库的构建具有灵活性，可在RNA或蛋白质水平上进行修改。在RNA水平上，可将同源区域、致病突变、多态性或随机突变引入寡核苷酸序列中。在蛋白质水平上，RNA结合因子可通过磷酸化或其他翻译后修饰进行修饰。此外，还可调控结合环境，以增加或减少与目标RNA结合蛋白相互作用或竞争的其他因子的水平。

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