一种用于绘制人pre-mRNA上核糖核蛋白（RNPs）结合位点的快速高通量方法

摘要

由于前体mRNA具有瞬时性，因此难以分离和研究 体内. 此处，我们介绍一种新型的 体外 利用覆盖pre-mRNA选定区域的合成寡核苷酸文库研究RNA-蛋白质相互作用的方法

摘要

对与RNA结合蛋白共免疫沉淀（co-IP）的RNA进行测序，已通过证明结合位点位置常影响剪接因子功能的方式，加深了我们对剪接机制的理解。然而，与任何取样策略一样，识别出与剪接因子结合的RNA的概率与其细胞内丰度成正比。我们开发了一种新颖的体外方法，用于检测在原本瞬时存在的前体mRNA（pre-mRNA）上的结合特异性。该方法利用一种特别设计的寡核苷酸文库，覆盖内含子、外显子、剪接位点或其他pre-mRNA区域。该文库经过某种分子筛选过程。本文通过将寡核苷酸分离为结合与未结合组分，并采用双色芯片策略记录结合组分中每种寡核苷酸的富集情况，展示了该方法的应用。芯片数据可生成高分辨率图谱，能够识别核糖核蛋白（RNP）在pre-mRNA上结合的序列特异性和结构决定因素。该方法的一个独特优势在于，可避免当前免疫沉淀（IP）和SELEX技术中存在的、对mRNA丰度依赖的取样偏差，因为该寡核苷酸文库是依据pre-mRNA序列专门设计并合成的。寡核苷酸文库的灵活性是另一优势，实验者可根据研究需求自主选择目标区域并进行覆盖设计，从而定制化构建文库。利用该技术，可大规模检测多态性或突变对结合的影响，或将文库克隆至功能性剪接报告系统中，鉴定在包含组分中富集的寡核苷酸。这种新颖的体外高分辨率作图方案，为研究RNP与低丰度、瞬时存在的pre-mRNA分子之间的相互作用提供了独特途径，而此类分子因丰度极低，难以通过现有的体内技术进行有效研究。

方案

引物池设计与引物回收

1. 第一步是设计要研究的前体 mRNA 池。可以使用 UCSC 基因组浏览器下载特定基因、剪接位点或其他感兴趣的区域来完成此步骤。
2. 选定感兴趣的区域后，使用以下条件在计算上对其进行平铺：读长应为 30 个核苷酸，重叠 10 个核苷酸，因此每个寡核苷酸相对于前一个移动 20 个核苷酸。*在剪接位点附近应增加寡核苷酸的重叠度以确保足够的覆盖度；将重叠从 10 个核苷酸增加到 20 个核苷酸即可实现这一点。
3. 在每个 30 核苷酸的寡核苷酸两端添加通用引物序列，用于后续扩增该寡核苷酸池。应将平铺的寡核苷酸序列订单提交给 Agilent，由其在定制的寡核苷酸微阵列上进行合成。
4. 从微阵列表面回收 DNA 寡核苷酸时，首先将阵列盖玻片放入杂交腔室中，并轻轻加入 500 μL 的 dH₂O 至玻片表面
5. 将阵列夹在盖玻片上方，注意避免产生气泡，以免干扰过程。务必使阵列面朝下放置，使带有寡核苷酸的一侧接触水面。一个简便的判断方法是“Agilent 接触 Agilent”，即阵列上的 Agilent 标签与盖玻片上的 Agilent 标签相对
6. 封闭杂交腔室，并在杂交炉中于 99°C 旋转过夜
7. 次日，小心地从腔室中取出阵列并吸出液体，此时液体中已含有从阵列表面释放的寡核苷酸，即为寡核苷酸池
8. 将该寡核苷酸池转移至 1.5 mL Eppendorf 管中，并以 50% 振幅进行 3–5 秒脉冲超声处理
9. 接下来，使用带有 T7 标签的通用引物通过低循环数 PCR 扩增该寡核苷酸池。第一轮反应：94°C 变性 1 分钟，55°C 退火 20 秒，72°C 延伸 1 分钟；后续循环中，各步骤分别在对应温度下进行 10 秒、20 秒和 10 秒，并在 72°C 进行最终 5 分钟的延伸。由于扩增寡核苷酸池所需的循环数取决于寡核苷酸回收效率，可能需要尝试多个循环数。注意避免过度扩增，过度扩增在聚丙烯酰胺凝胶上表现为弥散条带。PCR 扩增后的样品可保存在 4°C 直至使用。
10. 寡核苷酸制备的最后一步是使用 Ambion 的 MEGAshortscript™ 试剂盒转录 RNA。*以下方案改编自 Ambion
    1. 在室温下解冻 T7 10× 反应缓冲液、四种核糖核苷酸溶液和水，同时将 T7 酶混合物保持在冰上
    2. 在无 RNase 的微量离心管中于室温下配制反应体系。若在冰上混合反应体系，反应缓冲液中的组分可能导致模板 DNA 沉淀
    3. 按以下顺序加入：3 μL 无核酸酶水、2 μL 10× 反应缓冲液、每种 75 mM nTP 溶液各 2 μL、5 μL 模板 DNA（PCR 扩增后的寡核苷酸池）和 2 μL T7 酶，总体积为 20 μL
    4. 轻轻弹击管壁混匀，短暂离心以使液体沉至管底
    5. 在热循环仪中于 37°C 孵育 2 小时。孵育时间依赖于模板，因此可能需要通过时间进程实验确定最大产量所需的最适孵育时间
    6. 2 小时后，向反应体系中加入 1 μL Turbo DNase 以去除模板 DNA，并在 37°C 额外孵育 15 分钟
    7. 通过酚/氯仿抽提和乙醇沉淀终止反应并回收 RNA。
       1. 对于 20 μL 反应体系，向反应液中加入 115 μL dH₂O 和 15 μL 3 M 醋酸钠。
       2. 充分混匀后加入 75 μL 酸性酚和 75 μL 氯仿，涡旋混合，然后在室温下以 13,000 rpm 离心 1 分钟。将水相转移至新管中，并重复抽提一次
       3. 将水相转移至新管，加入 150 μL 氯仿，涡旋混合后按前述条件离心，再将水相转移至新管。
    8. 向水相中加入两倍体积的预冷 100% 乙醇，充分混匀。在 -20°C 冷却至少 15 分钟，然后在 4°C 以最大速度离心 15 分钟以沉淀 RNA。小心弃去上清液，将沉淀重悬于 105 μL 0.1× Tris-EDTA（TE）缓冲液中。
11. 很难完全去除 T7 试剂盒反应中的游离核苷酸，因此为获得最准确的结果，应使用 RiboGreen 对 RNA 进行定量。
    1. 开始定量前，首先稀释足够的 1× TE 缓冲液，每样本需 2,300 μL + 50 μL。
    2. 接下来配制 RiboGreen 溶液。每样本需 1000 μL + 50 μL。对于高浓度样本（1 μg/mL 至 20 ng/mL），将 RiboGreen 以 1:200 比例溶于 1× TE；对于低浓度样本（50 ng/mL 至 1 ng/mL），以 1:2000 比例溶于 1× TE。从 A1 孔开始，沿列方向（非横向）向不透光板的每个孔中加入 50 μL RiboGreen 溶液
    3. 将 RNA 储备液稀释至高浓度样本为 2 μg/mL，或低浓度样本为 100 ng/μL
    4. 使用储备液建立标准曲线：对原始 2 μg/mL 或 100 ng/μL 储备液进行连续六次 1:2 稀释。将 240 μL 储备液加入 PCR 条形管中，在其余 7 个管中各加入 120 μL 1× TE。取 120 μL 储备液加入第 2 管并混匀，再取 120 μL 第 2 管溶液加入第 3 管，依此类推至第 7 管。第 8 管仅含 TE，作为空白对照。将标准曲线溶液各 50 μL 加入不透光板 A1:H2 孔中（标准曲线重复两遍）
    5. 在新管中将 45 μL TE 与 5 μL 寡核苷酸池混合，然后将全部 50 μL 加入已含 50 μL RiboGreen 的孔中
    6. 使用酶标仪，设置激发波长为 485 nm，发射波长为 530 nm，顶部读数，先混匀 1 分钟后读取荧光值
    7. 利用生成的标准曲线对回收的 RNA 进行定量，并将 RNA 储存于 -20°C。

目的RNP与寡核苷酸池的共免疫沉淀

1. 在开始共免疫沉淀实验之前，将Invitrogen的Protein A和Protein G Dynabeads按1:1比例混合，每反应总体积为50 μL。例如，进行两个反应时，每种磁珠各加入50 μL。
2. 使用Novagen等品牌的磁力分离架固定磁珠，吸除上清液，并用等体积的冷1×PBS洗涤磁珠两次。
3. 第二次洗涤后，将磁珠重悬于等体积的冷1×PBS中，并按每反应加入2 ng抗体。此用量可能因抗体而异，需通过实验优化以确定最佳条件。
4. 将抗体与磁珠的混合物置于4°C旋转仪中孵育过夜。
5. 次日早晨，每反应加入2 μg经超声处理的酵母总RNA以阻断非特异性结合，并在4°C继续旋转孵育30分钟。
6. 使用磁力架固定磁珠，吸除上清液，并用冷1×PBS洗涤磁珠两次，第二次洗涤后将PBS保留在管中。
7. 取新的离心管，每反应一管，将50 μL磁珠混合物分装至各管中。在配制主混合液时让磁珠静置。
8. 每反应加入200 ng寡核苷酸池、等摩尔比的保护引物、2 μg经超声处理的酵母总RNA、20 μL HeLa细胞核提取物（作为RNP来源），并用缓冲液E补足至120 μL。保护引物是通用引物的RNA版本。订购带有T7标签的通用引物转录模板，然后使用MEGAshortscript™试剂盒从模板转录生成RNA。
9. 吸除磁珠分装液中的上清液，将磁珠重悬于120 μL主混合液中，在4°C轻轻摇动孵育1–2小时。
10. 孵育结束后，从每反应中取出少量等分试样（包含磁珠）作为“总”RNA样品。
11. 将剩余反应液置于磁力分离架上，吸除上清液。尽管后续分析中无需检测该流穿样品，但建议保存以备使用。
12. 用50 μL冷1×PBS洗涤磁珠1–2次。磁珠上由抗体捕获的RNA即为“IP”样品。
13. 将“总”和“IP”磁珠样品分别重悬于50 μL含1% SDS的0.1×TE缓冲液中，于65°C加热15分钟以洗脱RNA。
14. 收集上清液，其中含有先前结合在磁珠上的RNA，通过酚/氯仿抽提纯化，随后进行乙醇沉淀。干燥沉淀后，将其重悬于50 μL 0.1×TE缓冲液中。

为氨基烯丙基标记做准备的共免疫沉淀样本的逆转录与扩增

1. 接下来，RNA 样本必须进行逆转录和 PCR 扩增。对于逆转录反应，请使用通用反向引物。
2. 对于每个样本，首先将 1 μL 通用反向引物与 1 μL 模板 RNA（来自免疫沉淀反应）和 10 μL dH₂O 混合。在 70°C 下加热反应物 5 分钟，然后置于冰上冷却或保持在 4°C。
3. 在样本冷却的同时，配制以下主混合液。每项反应中加入 4 μL 10 mM dNTPs、2 μL 10x Arrayscript 缓冲液、1 μL RNase 抑制剂和 1 μL 逆转录酶。充分混匀后，向每项逆转录反应中加入 8 μL 主混合液。
4. 使用 PCR 仪将样本在 42°C 下孵育 2 小时，随后在 95°C 下孵育 5 分钟，最后在 4°C 下保存，直至需要进行扩增。
5. 在完成 RNA 样本的逆转录后，使用带有 T7 标签的通用引物之一进行 PCR 扩增。扩增文库所需的循环次数取决于共免疫沉淀（co-IP）的效率，因此可能需要尝试多个循环数。每项反应需包含 5 μL 10x Taq 反应缓冲液、0.2 μL 每种引物（100 mM）、1 μL cDNA 模板（来自逆转录反应）、1 μL 10 mM dNTPs、42.2 μL dH₂O 和 0.4 μL Taq 酶。
   
   PCR 起始步骤为在 94°C 下孵育 3 分钟。随后，每个循环包括：94°C 变性 45 秒，55°C 退火 30 秒，72°C 延伸 1 分钟，最后在 72°C 下最终延伸 10 分钟。
6. 接下来，再次使用 MEGAshortscript™ 试剂盒对样本进行转录，但此次加入 2 μL 氨基烯丙基 UTP（aminoallyl UTP），代替 T7 UTP。氨基烯丙基 UTP 将用于通过 Cy 染料对 RNA 进行标记。
7. 使用酚/氯仿抽提及乙醇沉淀法处理样本。切勿使用 Glycoblue 或乙酸铵，二者均可能干扰样本与芯片的杂交。将沉淀干燥后，重悬于 4.5 μL 0.1 M 碳酸钠溶液中。

使用Cy染料对RNA进行氨基烯丙基标记

1. 开始标记实验时，将荧光染料 Cy3 和 Cy5 分别溶于 45 μL DMSO 中。为避免光照，用铝箔纸包裹管子，并于 -20°C 避光保存
2. 向 RNA 样品中加入 2.5 μL 无核酸酶水，并充分混匀
3. 接着，向“total”样品中加入 3 μL Cy3，向“IP”样品中加入 3 μL Cy5。将样品在室温下避光孵育 1 小时；Cy3 样品将变为红色或粉红色，而 Cy5 样品将变为蓝色
4. 为终止反应，向每个样品中加入 6 μL 4 M 盐酸羟胺，充分混匀后短暂离心。室温孵育 15 分钟
5. 通过苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀纯化标记后的样品，将沉淀重悬于 50 μL 0.1x TE 中

使用安捷伦微阵列杂交试剂盒将样品与微阵列杂交

1. 开始杂交：轻柔混合 50 μL 10x 封闭缓冲液、140 μL 无核酸酶水（H2_O）、25 μL Cy3 标记的“总”探针池、25 μL Cy5 标记的“IP”探针池、10 μL 25x 断裂缓冲液以及 250 μL 2x 杂交缓冲液，注意避免产生气泡。短暂离心样品，使溶液聚集于管底并减少气泡。
2. 将 O 型圈盖玻片放入杂交室中，小心地将溶液用移液器加至玻片上。
3. 将检测芯片置于盖玻片上方，形成“三明治”结构包裹溶液。注意芯片方向，确保芯片上的 Agilent 标签与盖玻片上的 Agilent 标签相对。
4. 用夹具固定玻片/芯片三明治结构，在 50°C 下旋转孵育 3 小时。
5. 在芯片旋转孵育期间，于 50 mL 锥形管中配制以下溶液各 50 mL：一管含 50 mL 去离子水（dH₂O），两管分别含 1x SCC 缓冲液，另有一管含 2x SCC 缓冲液。
6. 三小时孵育结束后，小心松开夹具，取出芯片/玻片三明治结构，并将其放入盛有 2x SCC 缓冲液的 50 mL 锥形管中。使用镊子轻轻将芯片与盖玻片分离，并取出盖玻片。注意在取出过程中避免触碰芯片表面。盖紧管盖，轻轻倒置混匀 60 秒。
7. 用镊子将芯片转移至第一管 1x SCC 溶液中，盖紧管盖，轻轻倒置 1 分钟，随后将芯片转移至第二管 1x SCC 溶液中，再次轻轻倒置 1 分钟。
8. 最后，将芯片转移至去离子水（dH₂O）管中，轻轻倒置 30 秒。
9. 将玻片边缘置于吸水纸上干燥。持续在吸水纸上旋转芯片，确保不破坏含有寡核苷酸的一侧。
10. 将干燥后的芯片放入空的 50 mL 锥形管中，使用微阵列扫描仪进行扫描。

解读微阵列

1. 微阵列扫描仪将生成该阵列的 TIF 图像。使用安捷伦（Agilent）提供的、针对您特定文库的网格文件，通过安捷伦特征提取软件处理该图像。
2. 安捷伦软件将解读每个特征点的信号，生成一个数据文件，并通过 Perl 脚本进行解析。每个特征点的信号将根据该通道的总信号强度进行归一化。例如，在绿色通道的某一特定特征点，该特征点的绿色信号强度将除以所有特征点绿色通道的总信号强度。最终输出结果为阵列上每个特征点红色通道与绿色通道信号的对数比值。
3. 来自微阵列的寡核苷酸文库数据可重新比对回基因组，以获得目标 RNP 结合位置及其结合强度的信息。

图1. 实验示意图

A. 平铺策略。在选定并下载感兴趣的pre-mRNA序列后，目标区域以30个核苷酸为窗口进行平铺，每次移动10个核苷酸。每个窗口两侧均包含通用引物结合位点。

B. 合成阵列。应向Agilent提交分段排列的寡核苷酸订单，由其将序列打印至定制的寡核苷酸微阵列上。

C. 免疫共沉淀。将寡核苷酸从芯片上煮脱后，与HeLa细胞核提取物孵育，然后将该提取物加入已用针对目标RNP的抗体处理过的磁珠中。用Cy3标记起始寡核苷酸文库，用Cy5标记免疫沉淀后结合的文库，随后应用于检测芯片并进行扫描。

图2. 基因组注释及富集数据分析。

A. 将阵列数据中每个基因组坐标位置的平均得分转换为以10为底的对数，并将该得分映射到相应的坐标位置。图中以3个重叠的30-nt寡核苷酸为例说明此平均步骤，其得分分别为2、4和0.5，每个10-nt窗口的平均富集得分如上方所示。所选基因组区域可通过UCSC基因组浏览器中的自定义轨迹进行可视化。图中示例浏览器窗口位于clta基因区域，底部显示基因特征（外显子/内含子/可变剪接等），而来自PTB结合寡核苷酸的对数平均富集得分则以深红色垂直条形表示。PTB在多聚嘧啶 tract区域的外显子2上游位置强烈结合。

讨论

进行此操作时，重要的是要记住，文库的构建具有灵活性，可在RNA或蛋白质水平上进行修改。在RNA水平上，可将同源区域、致病突变、多态性或随机突变引入寡核苷酸序列中。在蛋白质水平上，RNA结合因子可通过磷酸化或其他翻译后修饰进行修饰。此外，还可调控结合环境，以增加或减少与目标RNA结合蛋白相互作用或竞争的其他因子的水平。