本方案展示了电压敏感染料如何实现对完整神经网络（如豚鼠肠神经系统中的神经丛）电活动的光学记录，其分辨率可调，范围从单个细胞到多神经节环路。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
肠神经系统（ENS）是一个具有明确功能的自含式神经网络，能够在隔离状态下执行复杂行为。其神经元（直径为10至25 μm）排列成神经丛，局限于肠壁的不同平面内。1; 肌间神经丛位于纵行肌层与环形肌层之间，黏膜下神经丛则位于环形肌层与黏膜之间。由于这些神经丛的效应系统（转运性上皮、内分泌细胞、免疫成分、血管和平滑肌）也包含在肠壁内，因此可以制备出保留不同反射通路各个独立组分的半完整标本。效应系统的活动由黏膜下神经丛和肌间神经丛协同调控。因此，要理解胃肠道的正常功能，必须深入了解神经节内及神经节间的突触相互作用，以及不同神经丛之间的通信机制。肠神经系统（ENS）作为一个完整的神经系统，是一种独特的实验模型，可用于将分子和细胞事件与神经网络的电活动及其生理输出相关联。由于其神经丛具有准二维结构，肠神经系统特别适用于利用电压敏感性染料进行多点光学记录技术来研究神经网络。2,7,8,9. 我们将在此介绍一种相对较新的萘苯乙烯基吡啶𬭩染料（di-4-ANEPPDHQ）的使用方法3具有比其前代染料更多的优势，包括极低的光毒性、缓慢的内化速率以及卓越的化学稳定性。当与能够实现亚毫秒级时间分辨率的相机联用时，该染料可使我们以100倍放大下约2.5 μm的最大空间分辨率，监测视野中所有神经元的电活动。在较低放大倍数（10倍或20倍）下，尽管牺牲了单细胞分辨率，但获得了更广阔的视野，从而揭示了神经节间环路的复杂结构。
方案
第1部分：组织制备
- 通过连续解剖150-200克（2-3周龄）哈特利豚鼠的小肠，分离获得黏膜下神经丛和肌间神经丛标本。豚鼠通过吸入异氟烷麻醉后断头处死。安乐死后，取出小肠，并用预热的含氧溶液冲洗肠腔以清除内容物。我们使用M199培养基，添加25 mM HEPES、5 mM NaHCO3 和2 mM谷氨酰胺，并将pH调节至7.4（以下简称M199-DM），该溶液已预热至37 °C。然而，后续所有操作步骤均在室温下进行。
- 取一段8-10厘米长的肠段，转移至盛有M199-DM的硅胶培养皿中，沿肠系膜缘剪开，并用昆虫针将黏膜面朝上固定。保持均匀张力极为重要，固定后的组织应呈矩形，黏膜绒毛排列整齐。
- 使用尖端平直的精细Dumont镊子，几乎水平操作，从标本一端夹住绒毛，沿组织纵轴轻轻拉扯，即可轻松剥离黏膜。当样本被均匀固定时，可在几次操作中分离出条带状的黏膜，暴露出含有黏膜下神经节和黏膜下血管的黏膜下层。
- 对于神经丛的精细解剖，我们建议使用配备暗场照明的解剖显微镜。这种照明方式产生的伪三维效果有助于区分各组织层，从而避免或尽量减少器械对组织的损伤。
- 制备黏膜下层标本时，我们采用Hirst和McKirdy4的经典方法，具体步骤如下：a）沿环形肌纤维走向在黏膜下层做一切口，可使用极精细的剪刀（如Moria MC19或其等效产品）完成；b）用精细镊子非常轻柔地提起黏膜下层，同时用精细剪刀将环形肌层向下推压；c....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本方案的撰写基于两个目标。第一个目标是说服其他研究者：得益于过去十年中的众多技术进步，利用电压敏感染料进行电活动的光学记录已成为研究完整神经网络最强大、最可靠且成本较低的方法之一；事实上，即使资源有限的实验室也能轻松实施该技术。第二个目标是推广肠神经系统作为一种独特的实验模型，可用于关联分子与细胞事件和两个神经丛的电活动行为及其生物学输出。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
我们感谢CHOP的D.A. Coulter允许我们使用他的双光子显微镜获取视频开头所示的双光子图像，并感谢H. Takano与我们分享他的专业技术知识。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M3769 | 含 Earle’s 盐，不含 L-谷氨酰胺、酚红和碳酸氢钠 |
| Sylgard | Dow Corning | 184 硅酮弹性体试剂盒 | |
| 用于解剖的昆虫针 | F.S.T. | 26001-30 | |
| Dumont 镊子 | F.S.T. | 11203-23 或 11200-33 | |
| Moria MC19/B Pascheff-Wolff 弹簧剪刀 | F.S.T. | 15371-92 | |
| 实验过程中固定组织用针 | Seirin Corp. | Seirin Spinex | |
| 胶原酶 VII | Sigma-Aldrich | C0773 | |
| 蛋白酶 IX | Sigma-Aldrich | P6141 | |
| 胎牛血清 | Invitrogen | 10439-016 | |
| 青霉素-链霉素溶液（PenStrep） | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| L-谷氨酰胺 100X | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| 硝苯地平 | Sigma-Aldrich | ||
| Di-4-ANEPPDHQ | Molecular Probes, Life Technologies | D36802 | |
| 四通道刺激发生器 | Multi Channel System MCS GmbH | 2000 系列 | |
| 蠕动泵 | Rainin | 双通道 Dinamax RP-1 | |
| 高速相机 | RedShirtImaging, LLC | NeuroCCD-SM | |
| 1:10 减倍镜 / 中继透镜 | Optem, Qioptiq Inc. | ||
| 正置显微镜 | Olympus Corporation | BX61TRF | |
| 带电动 X-Y 平移台的 Gibraltar 固定载物台 | Gibraltar, Burleigh Instruments, EXFO, Quebec, Canada | PSSG--BX2 | |
| 线性矩阵电极 | FHC, Inc. | 定制 | |
| 主动隔振台 | Halcyonics,Inc., Menlo Park, CA | Micro 60 | |
| 超低纹波反馈稳压电源 | Kepco, Flushing, NY | ATE 75-15M | |
| 热滤光片 | Schott AG | KG-1 | |
| 高Q值干涉滤光片 | Chroma Inc. | HQ530/50 | |
| 二向色镜 | Chroma Inc. | 565 nm（50% 透射率） | |
| 长通滤光片 | Chroma Inc. | HQ572LP | |
| 声学窗帘 | Acoustical Surfaces, Inc. | BSC-25 | |
| Neuroplex | RedShirtImaging, LLC | ||
| IDL | ITT Visual Information Solutions | ||
| 高分辨率 CCD 相机及其独立的相机控制器 | Hamamatsu Corp. | ||
| 高分辨率相机用图像采集卡 | Data Translation | DT3120K-1 | |
| 高分辨率相机成像软件 | Data Translation | Global Lab Image/2 |
参考文献
- Johnson, L. eonard R. in Physiology of the Gastrointestinal Tract, edited by Leonard R. , Raven Press. New York. 1-1 (1987).
- Obaid, A. L. Spatiotemporal patterns of activity in an intact mammalian network with single-cell....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
