使用电压敏感性染料对豚鼠肠神经系统网络中的电活动进行光学记录

摘要

本方案展示了电压敏感染料如何实现对完整神经网络（如豚鼠肠神经系统中的神经丛）电活动的光学记录，其分辨率可调，范围从单个细胞到多神经节环路。

摘要

肠神经系统（ENS）是一个具有明确功能的自含式神经网络，能够在隔离状态下执行复杂行为。其神经元（直径为10至25 μm）排列成神经丛，局限于肠壁的不同平面内。¹; 肌间神经丛位于纵行肌层与环形肌层之间，黏膜下神经丛则位于环形肌层与黏膜之间。由于这些神经丛的效应系统（转运性上皮、内分泌细胞、免疫成分、血管和平滑肌）也包含在肠壁内，因此可以制备出保留不同反射通路各个独立组分的半完整标本。效应系统的活动由黏膜下神经丛和肌间神经丛协同调控。因此，要理解胃肠道的正常功能，必须深入了解神经节内及神经节间的突触相互作用，以及不同神经丛之间的通信机制。肠神经系统（ENS）作为一个完整的神经系统，是一种独特的实验模型，可用于将分子和细胞事件与神经网络的电活动及其生理输出相关联。由于其神经丛具有准二维结构，肠神经系统特别适用于利用电压敏感性染料进行多点光学记录技术来研究神经网络。^2,7,8,9. 我们将在此介绍一种相对较新的萘苯乙烯基吡啶𬭩染料（di-4-ANEPPDHQ）的使用方法³具有比其前代染料更多的优势，包括极低的光毒性、缓慢的内化速率以及卓越的化学稳定性。当与能够实现亚毫秒级时间分辨率的相机联用时，该染料可使我们以100倍放大下约2.5 μm的最大空间分辨率，监测视野中所有神经元的电活动。在较低放大倍数（10倍或20倍）下，尽管牺牲了单细胞分辨率，但获得了更广阔的视野，从而揭示了神经节间环路的复杂结构。

方案

第1部分：组织制备

1. 通过连续解剖150-200克（2-3周龄）哈特利豚鼠的小肠，分离获得黏膜下神经丛和肌间神经丛标本。豚鼠通过吸入异氟烷麻醉后断头处死。安乐死后，取出小肠，并用预热的含氧溶液冲洗肠腔以清除内容物。我们使用M199培养基，添加25 mM HEPES、5 mM NaHCO₃ 和2 mM谷氨酰胺，并将pH调节至7.4（以下简称M199-DM），该溶液已预热至37 °C。然而，后续所有操作步骤均在室温下进行。
2. 取一段8-10厘米长的肠段，转移至盛有M199-DM的硅胶培养皿中，沿肠系膜缘剪开，并用昆虫针将黏膜面朝上固定。保持均匀张力极为重要，固定后的组织应呈矩形，黏膜绒毛排列整齐。
3. 使用尖端平直的精细Dumont镊子，几乎水平操作，从标本一端夹住绒毛，沿组织纵轴轻轻拉扯，即可轻松剥离黏膜。当样本被均匀固定时，可在几次操作中分离出条带状的黏膜，暴露出含有黏膜下神经节和黏膜下血管的黏膜下层。
4. 对于神经丛的精细解剖，我们建议使用配备暗场照明的解剖显微镜。这种照明方式产生的伪三维效果有助于区分各组织层，从而避免或尽量减少器械对组织的损伤。
5. 制备黏膜下层标本时，我们采用Hirst和McKirdy⁴的经典方法，具体步骤如下：a）沿环形肌纤维走向在黏膜下层做一切口，可使用极精细的剪刀（如Moria MC19或其等效产品）完成；b）用精细镊子非常轻柔地提起黏膜下层，同时用精细剪刀将环形肌层向下推压；c）随着分离进展，沿纵向边缘剪开，使黏膜下层与其余组织分离；d）在距离第一切口一定位置处，沿环形肌纤维方向做第二次切口，以确定最终黏膜下层标本的大小。所得黏膜下层片段仅厚30至50 μm，呈薄纱状，可转移至另一盛有新鲜M199-DM的硅胶培养皿中，轻轻且无张力地固定，并置于充氧环境中备用。
6. 原始肠段在去除黏膜和黏膜下层、暴露环形肌后，仍可用于制备肌间神经丛标本。为暴露肌间神经丛，需尽可能去除环形肌层。此步骤可使用前述相同平头精细镊子完成。先从标本一侧，再从另一侧轻柔地拉去肌纤维束。暴露的肌间神经丛无法与纵行肌层及下方的浆膜分离。因此，“肌间神经丛标本”指的是可沿固定针剪下的组织段。由于其含有活体肌肉，建议将其非常松弛地固定于盛有充氧M199-DM的培养皿中，直至生理实验开始。
7. 由于黏膜是肠神经系统（ENS）的主要感受器，且所有效应器均嵌于肠壁内，因此可制备保留完整反射通路的半完整标本。这些“定制化”标本需结合1.3至1.6节所述步骤，应用于分离肠段的相邻区域。
8. 在正式进行光学实验前几分钟，将选定标本安装至实验腔室，确保张力分布均匀，组织完全平整贴附于硅胶底部。可通过多个极细的固定针在标本周围均匀固定，避免造成组织损伤。

第二部分：光学记录用组织样本的制备

1. （可选）为防止染料与残留的平滑肌和结缔组织结合而产生背景荧光，可将分离的神经丛在含胶原酶VII（≤50 U/ml）和蛋白酶IX（≤0.5 μg/ml）的M199-DM培养基中孵育30–60分钟。酶处理后，组织样本应使用M199-DM清洗，并在含10%动物血清（如马或牛血清）及抗生素（青霉素100 U/ml；链霉素100 μg/ml）的M199-DM培养基中于95% O₂ 和5% CO₂ 饱和的培养环境中过夜维持。该步骤我们已使用多年，因其显著提高光学记录的信噪比，但对于初学者可能并不适用，应谨慎采用。事实上，在解剖过程中受损的组织样本在酶处理期间存在解体的风险。然而，即使不进行酶处理，我们也建议将组织样本在含血清和抗生素的M199-DM培养基中过夜维持，此步骤有助于急性解剖损伤后的组织修复，并提高样本的透明度。
2. 在肌肉持续收缩的组织样本中无法实现电活动的光学记录。因此，在记录肌间神经丛时，为防止肌肉收缩，我们建议在光学实验开始前数分钟向浸泡组织的M199-DM培养基中添加2 μM硝苯地平。

第3部分：使用di-4-ANEPPDHQ染色

1. Di-4-ANEPPDHQ 可以以冻干粉形式从商业渠道获得。我们建议将其溶于纯乙醇中，配制成高浓度的储备液（例如 15–20 mg/ml）。该储备液在 -20°C 条件下保存时极为稳定。事实上，我们实验室最近用完了近六年前配制的一批染料储备液的最后一滴。
2. 染色液应使用 M199-DM 配制，若实验方案需要，应添加 2 μM 的硝苯地平。染料的终浓度可低至 5 μg/ml，但不应超过 50 μg/ml。然而，由于储备液浓度不同，染色液中将含有一定量的乙醇，这一点需加以考虑。例如，若使用 15 mg/ml 的储备液配制含 50 μg/ml 染料的染色液，则其中乙醇含量约为 0.3%；而若储备液浓度仅为 5 mg/ml，则乙醇含量接近 1%。
3. 染色时，将组织样本浸入染色液中 10–30 分钟。染色结束后，洗去染料并更换为新鲜的、充氧 M199-DM。由于 Di-4-ANEPPDHQ 是一种不能穿透细胞膜的染料，仅在脂质环境中才会产生荧光，因此经染色的肠神经系统样本中健康的神经元应呈现为空心气球状。

第4部分：电刺激

1. 刺激可通过电压或电流驱动。我们采用电流刺激，由计算机控制的四通道刺激器提供，每个通道最大输出为 16 mA。
2. 实验中所用电极的型号取决于实验目的。当目标是刺激特定神经元时，可使用细胞内移液管或膜片电极。当需要激活某一神经节中的多个神经元时，可使用接触神经索的细胞外电极。为了研究相互连接的神经节，可采用大尺寸、低电阻电极和/或多通道电极阵列；然而，由于我们通常采用电流刺激，多通道电极阵列成为唯一选择。多种型号的细胞外电极以及部分线性电极阵列均可从商业渠道直接获得。
3. 电极可通过不同类型的显微操作器进行定位。为避免细长套管引起的振动，我们倾向于使用带磁性底座的小型显微操作器，将其置于实验槽附近，并用细而刚性强的金属杆支撑钨电极的柔性套管。

第5部分：灌注

我们使用一个双通道蠕动泵，其中一个通道用于输入含氧溶液，另一个通道用于输出。为了消除灌流引起的机械干扰，在采集光学数据期间会关闭泵。

第6部分：用于多点膜电位光学记录的装置

1. 光学组件：
   
   用于膜电位多点光学记录的装置包括 NeuroCCD-SM 相机（RedShirtImaging）和安装在直立显微镜三目镜筒上的 1:10 减倍镜/中继透镜。显微镜安装在 X-Y 平移台上，独立于固定在主动隔振台顶部的样品台。为最大限度减少空气中的振动干扰，整个装置被厚重的声学帘幕和聚酯薄膜顶棚包围。透射照明由一个 100 W 钨卤素灯提供，该灯由超低纹波反馈稳压电源供电。入射光通过热滤光片、高 Q 值干涉滤光片（HQ530/50）和 565 nm（50% 透光率）二向色镜实现准单色化。荧光发射光通过二向色镜和长通滤光片（HQ572LP）分离。入射光强度通过中性密度滤光片进行调节。透射照明用于样本的明场观察，由第二个 100 W 钨卤素灯提供，该灯由 0–55 V、1–10 A 电源驱动，无需具备特殊性能。
   
   
2. 高速相机规格：
   
   NeuroCCD-SM 相机的电子设计和性能特征已有详细描述³。简而言之，它是一款冷却型、低分辨率、高精度高速相机，采用背照式、薄化型 Marconi CCD39-01 芯片（80×80 像素）。模数转换为 14 位，全帧速率为 2 kHz。然而，根据特定需求，可通过多种像素合并模式或减少有效像素数量，将帧率提高至最高 10 kHz。该相机具有极低读出噪声的重要优势（2 kHz 时为 23 个电子，1 kHz 时为 9 个电子）。此外，其像素具有相对较大的阱深（215,000 个电子），可在高帧率下允许中等光强照射。
   
   
3. 数据采集与分析软件：
   
   光学实验由 Neuroplex 软件控制，该软件由 RedShirtImaging 提供，作为 IDL 平台（交互式数据语言）中的应用程序运行，具备光学数据采集、显示和分析所需的多种功能。
   
   
4. 附加相机：
   
   作为装置的组成部分，显微镜三目镜筒上的分光镜将样本图像投射至第二台高分辨率 CCD 相机，该相机连接至图像采集卡。图像通过 Global Lab Image/2 软件采集和存储，可叠加在 NeuroCCD-SM 相机捕获的亚毫秒级时间分辨光学信号显示画面上，从而生成光学记录电压信号空间来源的精确图谱。在本实验室中，该相机的图像采集卡位于与功能数据采集计算机不同的另一台计算机中。因此，图像文件需在两台计算机之间传输，并在实现两台相机图像完美配准前，对高分辨率图像的尺寸和位置进行微调。

第7部分：光学实验

1. 每次功能记录之前，我们通过光学手段获取计划记录电活动区域的高分辨率黑白图像（如6.4节所述）。当该图像叠加到高速相机的像素图上时，有助于我们识别产生光学信号的结构。
2. 在适当的系统配置下，Neuroplex（见6.3节）还可控制快门并触发电刺激。由于高速数据采集需要较大的计算机运算能力，因此建议尽可能使用配备大容量内存和高容量硬盘的专用计算机。然而，这并非易事。例如，我们自己的系统已使用多年，所采用的数据采集板过大，无法安装在当前主流的计算机中。作为折中方案，我们专门配置了一台戴尔Precision 390计算机，配备500 GB硬盘和4 GB内存。该计算机使我们能够继续使用较旧但性能足够的A/D和D/A采集板，同时仍具备足够运算能力以支持实验运行。
3. 一旦数据采集完成，Neuroplex即可以多种互补格式显示结果，部分格式详述如下：
   1. 屏幕上一个称为“页面显示”的区域，可显示由80×80高速相机捕获的样本原始图像的单帧画面。将第二台相机获取的高分辨率图像（如6.4节和7.1节所述）叠加至该像素图上，可进一步提升操作者识别感兴趣区域的能力。
   2. 当通过鼠标选中“页面显示”中的特定像素时，Neuroplex会自动将其光学输出转换为曲线，显示这些像素随时间记录的光学变化幅度（例如，ΔF/F随时间的变化）。操作者可选择这些曲线反映单个像素的输出，或反映样本特定区域内多个位点的空间平均输出。
   3. 数据亦可以视频格式显示。
      
      然而，为确保从每次实验运行中充分提取所有信息，我们更倾向于对光学数据进行离线分析。此类分析的代表性结果可提供参考。

第8部分：如何在光学实验中实现技术质量

光学实验的技术成功最终由记录信号的信噪比来衡量。此外，良好的信噪比并非源于灵光一现，而是源于一个持续改进的过程。如同歌剧演出一样，最终效果取决于多种因素的协同作用。因此，要实现技术上可靠的光学实验，必须独立优化光学装置以及实验方案中每一步骤所需的操作技能。以下是可能存在问题的几个方面，以及一些避免未预料问题的建议⁵：

1. 噪声来源
   
   在使用电压敏感性染料记录电活动时，机械和光学稳定性至关重要，因为反映生理反应的相对变化（ΔF/F）相对较小（在大多数肠道记录中< 10% / 100 mV），而噪声信号通常预示着不良结果。因此，为了优化信噪比，必须消除或至少最大限度地减少两大主要干扰源的影响：a) 机械振动，以及 b) 光源波动。
   
   
   1. 机械振动可能由多种因素引起，包括实验装置的配置、建筑物的稳定性、附近电动设备、气流、声学噪声、液体流动或漂浮在灌流液中的颗粒。良好的隔振系统，以及在极端情况下使用隔音帘（例如，参见5.1节中的描述），可显著改善实验条件，其成本投入是值得的。此外，一些常识性措施也非常有效，例如对实验所用溶液进行过滤，或在装置的小型可移动部件上使用磁性底座。
   2. 光源在接近最大强度时最为稳定。因此，应为电源设置电流限制，并在必要时通过在光路中插入中性密度滤光片来降低光强，而不是通过降低电压来实现。弧光灯本质上噪声较大。相比之下，钨卤素灯或发光二极管（LED）更加稳定，应作为首选光源⁶。
      
      
2. 动物年龄
   
   解剖应使用年轻动物的肠道组织，因为随着年龄增长，肠道内的结缔组织会变硬，使得在不严重损伤两个神经丛中神经元的情况下分离各组织层变得更加困难，而这些神经元的传入和传出纤维可能跨越组织层边界，或沿肠道纵轴延伸较长距离。当研究目标为神经节内连接时，此建议可适当忽略；但当实验目的为分析神经节间回路或激活反射通路时，该建议极为重要。
   
   
3. 染料内化
   
   应尽可能使用最低浓度的染料，并尽量减少不必要的光照暴露。尽管di-4-ANEPPDHQ已被证明比其他染料光毒性更低，但随着组织状态的恶化，染料最终仍会被细胞内化。染料内化会显著增加背景荧光，从而降低信噪比³。
   
   
4. 电极维护
   
   
   1. 每次实验后应仔细且彻底清洗电极。钨电极尖端的有机沉积物会增加电极电阻，妨碍刺激效果。
   2. 市售钨电极的绝缘层非常脆弱，容易受损。绝缘层破损会导致电流分流，削弱刺激效果，并危及实验的成功。
      
      
5. 灌流风险
   
   灌流过程中切勿离开实验装置无人看管。如果蠕动泵的进液和出液流量未正确平衡，可能发生两种灾难性事件：
   1. 溢出可能导致显微镜遭受不可逆损坏。
   2. 组织标本可能在实验过程中干涸。
      
      
6. 软件问题
   
   必须熟悉控制数据采集与分析的软件。高速数据采集和/或生成非常大的文件容易使系统接近崩溃边缘，而Neuroplex软件容错性较差，若不遵守其运行边界条件，将频繁崩溃。当分析仅局限于有限的兴趣区域时，记录中的细微特征可能被忽略，而通过数据的视频显示则常常能揭示这些细节。

讨论

本方案的撰写基于两个目标。第一个目标是说服其他研究者：得益于过去十年中的众多技术进步，利用电压敏感染料进行电活动的光学记录已成为研究完整神经网络最强大、最可靠且成本较低的方法之一；事实上，即使资源有限的实验室也能轻松实施该技术。第二个目标是推广肠神经系统作为一种独特的实验模型，可用于关联分子与细胞事件和两个神经丛的电活动行为及其生物学输出。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Medium 199	Sigma-Aldrich	M3769	含 Earle’s 盐，不含 L-谷氨酰胺、酚红和碳酸氢钠
Sylgard	Dow Corning	184 硅酮弹性体试剂盒
用于解剖的昆虫针	F.S.T.	26001-30
Dumont 镊子	F.S.T.	11203-23 或 11200-33
Moria MC19/B Pascheff-Wolff 弹簧剪刀	F.S.T.	15371-92
实验过程中固定组织用针	Seirin Corp.	Seirin Spinex
胶原酶 VII	Sigma-Aldrich	C0773
蛋白酶 IX	Sigma-Aldrich	P6141
胎牛血清	Invitrogen	10439-016
青霉素-链霉素溶液（PenStrep）	GIBCO, by Life Technologies	15140
L-谷氨酰胺 100X	GIBCO, by Life Technologies	25030
硝苯地平	Sigma-Aldrich
Di-4-ANEPPDHQ	Molecular Probes, Life Technologies	D36802
四通道刺激发生器	Multi Channel System MCS GmbH	2000 系列
蠕动泵	Rainin	双通道 Dinamax RP-1
高速相机	RedShirtImaging, LLC	NeuroCCD-SM
1:10 减倍镜 / 中继透镜	Optem, Qioptiq Inc.
正置显微镜	Olympus Corporation	BX61TRF
带电动 X-Y 平移台的 Gibraltar 固定载物台	Gibraltar, Burleigh Instruments, EXFO, Quebec, Canada	PSSG--BX2
线性矩阵电极	FHC, Inc.	定制
主动隔振台	Halcyonics,Inc., Menlo Park, CA	Micro 60
超低纹波反馈稳压电源	Kepco, Flushing, NY	ATE 75-15M
热滤光片	Schott AG	KG-1
高Q值干涉滤光片	Chroma Inc.	HQ530/50
二向色镜	Chroma Inc.	565 nm（50% 透射率）
长通滤光片	Chroma Inc.	HQ572LP
声学窗帘	Acoustical Surfaces, Inc.	BSC-25
Neuroplex	RedShirtImaging, LLC
IDL	ITT Visual Information Solutions
高分辨率 CCD 相机及其独立的相机控制器	Hamamatsu Corp.
高分辨率相机用图像采集卡	Data Translation	DT3120K-1
高分辨率相机成像软件	Data Translation	Global Lab Image/2