通过双光子荧光漂白后恢复法测量扩散系数

摘要

本文将介绍利用多光子荧光漂白后恢复技术测量扩散系数的实验步骤。我们将首先沿光路对样品进行激光校准，并确定合适的实验参数，随后生成荧光恢复曲线并进行拟合分析。

摘要

多荧光漂白后恢复是一种显微镜技术，用于测量大分子的扩散系数（或类似的传输参数），可应用于两者in vitro和in vivo生物系统。多荧光漂白后恢复（multi-fluorescence recovery after photobleaching）实验通过使用强激光脉冲对荧光样品中特定区域进行光漂白，随后减弱激光强度，并监测来自该区域外仍具荧光的分子扩散进入以取代被漂白分子时的荧光恢复情况。我们的演示将首先调整激光光路，使其通过普克尔斯盒（Pockels Cell，激光调制器），并沿光路经过激光扫描盒和物镜，最终到达样品。为简化操作，我们将使用一种水溶性荧光染料作为样品。接下来，我们将确定适用于该样品的实验参数，包括监测功率和漂白功率、漂白持续时间、计数bin宽度（用于光子计数）以及荧光恢复时间。随后，我们将描述获取恢复曲线的步骤，该过程可通过LabVIEW软件（National Instruments，奥斯汀，德克萨斯州）实现高度自动化，从而提高实验通量。最后，通过使用最小二乘法拟合算法，将恢复数据拟合至适当的数学模型，从而确定扩散系数，此分析过程可方便地利用MATLAB软件（The Mathworks，纳蒂克，马萨诸塞州）进行编程实现。

方案

1. 调整光学元件。

进行MP-FRAP实验所需的关键设备包括：锁模激光器、普克尔斯盒（用于光束调制）、脉冲发生器、二向色镜、物镜、荧光发射滤光片、门控光电倍增管以及数据记录系统（光子计数器和多通道定标器）。

2. 确定安全的监测功率。

1. 将激光衰减至较低但合理的功率，以在样品中产生荧光。
2. 在样品内进行聚焦。
3. 设置一个光子计数器，使其积分时间远长于预期的荧光恢复时间。保持聚焦体积在样品内的位置固定（在我们的显微镜软件中，通过点扫描实现），记录足够数量的光子计数数据。
4. 增加激光功率，并采集另一组光子计数数据。重复此过程，直至光子计数的增加相对于功率的增加明显减缓。
5. 绘制 log(光子计数) 对 log(功率) 的曲线图。若斜率偏离 2，则表明在监测过程中发生了漂白。选择一个低于该拐点但能提供合理信噪比的功率作为监测功率。

3. 确定脉冲发生器和多通道定标器的输入参数。

1. 根据文献和/或斯托克斯-爱因斯坦方程（Stokes-Einstein equation）与扩散方程，估算扩散系数和恢复时间的数量级。
2. 在脉冲发生器和定标器上设置必要的参数值。
   1. 在脉冲发生器上，设置预漂白和漂白时间。经验法则建议：预漂白时间应为预期半数恢复时间的1至2倍，漂白时间应为预期半数恢复时间的十分之一。
   2. 在定标器上，将时间通道宽度（bin width）设置为漂白持续时间的大约一半，并设置每条记录的时间通道数（bins per record），使得所选通道宽度与每条记录通道数的乘积大于或约等于预期的完全恢复时间加上预漂白和漂白时间的总和。
   3. 返回脉冲发生器，将预漂白/漂白/监测序列的频率设置为略小于“通道宽度乘以每条记录通道数”之积的倒数的值。*
   4. 最后，根据所选监测功率下的信号强度，在定标器上设置每扫描次数的记录数。
      
      *必须确保脉冲发生器上设定的完整预漂白/漂白/监测序列周期（即1/频率）大于定标器上设定的数据采集时间（通道宽度 × 每条记录通道数）。若不满足此条件，定标器的单条记录中可能出现多个漂白触发信号。
3. 将监测功率设为先前确定的合适水平。将漂白功率设置为比监测漂白测试中确定的漂白阈值高出约200 mW。这些功率均通过在PC晶体两端施加不同电压来实现。
4. 封闭显微镜系统，关闭室内光源，开启光电倍增管（PMT），在显微镜软件中开始点扫描，随后启动脉冲发生器和定标器。
5. 通过绘制恢复曲线并标记三个关键点来分析所得恢复曲线：1）漂白前荧光强度，2）漂白后即刻荧光强度，3）数据集结束时的荧光强度。利用漂白前和漂白后即刻的荧光值，进一步估算半数恢复时间。
6. 根据此半数恢复时间的估算值，使用前述经验法则确定新的预漂白、漂白和通道宽度持续时间。同时，利用漂白前荧光强度和数据集结束时的荧光强度，更准确地估计达到完全恢复所需的时间。经验建议：采集数据的时间应足够长，以确保数据后半段能够反映完整的恢复过程。
7. 调整脉冲发生器和定标器的参数，获取新的曲线，并持续优化参数，直至曲线显示出明显的漂白效果和平滑的恢复过程。需注意，在条件允许时，漂白持续时间可且应低于经验推荐值。若漂白过浅或过深，也可相应调整漂白功率。

4. 检测激发饱和。

1. 根据先前确定的合适监测和漂白功率，采集一系列 MP-FRAP 曲线。使用适当的数学形式和非线性最小二乘拟合算法（见下文“数据分析”），将每次恢复过程相对于漂白前荧光强度进行归一化分析，并记录拟合得到的漂白深度参数值。
2. 继续在逐步提高漂白功率的条件下，采集并分析后续的多组 MP-FRAP 曲线。
3. 绘制漂白深度参数的对数与漂白功率对数的关系图。若所得斜率偏离 2，则表明存在激发饱和现象。选择一个能够产生较强漂白但不会引起饱和的漂白功率。

5. 继续采集 MP-FRAP 曲线。

1. 按照上述方法继续采集曲线，确保所有参数均已正确设置。

6. 数据分析。

1. 从荧光数据集中移除漂白前和漂白期间的数据，并调整时间数据，使 t = 0 对应漂白后立即测得的荧光值。
2. 将获得的荧光恢复曲线相对于漂白前平均荧光值进行归一化处理。
3. 使用适当的数学模型和非线性最小二乘拟合算法（例如 MATLAB 中的 lsqcurvefit 函数）对归一化曲线进行拟合。此处提供的模型适用于同时受扩散和对流流动影响的荧光恢复过程：
   
   其中 F_o 为漂白前平均荧光强度，β 为漂白深度参数，τ_D 为扩散恢复的特征时间，R 为双光子聚焦体积轴向（w_z）与径向（w_r）宽度平方的比值，τ_vx = w_r/v_x，τ_vy = w_r/v_y，τ_vz = w_z/v_z，而 v² = v_x² + v_y² + v_z² 表示对流流动的速度。 当流动局限于成像平面时，τ_vz → ∞，且 1/τ_vx + 1/τ_vy 可被 1/τ_vr 替代。在无对流流动的情况下，分子中的两个指数项均趋近于 1，表达式可大幅简化，仅保留两个拟合参数 β 和 τ_D。 扩散系数可直接计算为 D = w_r²/8τ_D。

7. 代表性结果。

图1. FITC-BSA 的典型漂白与恢复曲线。一条良好的恢复曲线应表现出明显的漂白效果和平滑的恢复过程，恢复完成后的荧光强度以数据后半段的数值表示。

图2. FITC-BSA（红色）的归一化恢复曲线及其对应的最小二乘法拟合曲线（黑色）。该拟合得到的扩散系数为52.9 µm²/s，与文献报道值一致。

讨论

多光子荧光漂白后恢复技术的强大之处在于其能够以三维分辨率探测厚样品。自20世纪90年代发展以来，MP-FRAP已被用于测定细胞体中的扩散系数（或类似的传输参数）， 离体 厚组织切片，以及 在体内 组织与间质。本文介绍了进行多光子荧光漂白后恢复（MP-FRAP）实验所需的设备，以及正确对准光路、设定实验参数、采集数据和分析恢复曲线的操作步骤。

选择合适的激发波长和发射滤光片应依据双光子吸收截面和发射光谱。这些信息通常包含在各种染料的技术参数中。此外，在调整激光光路时，必须确保物镜后透镜得到适当的过填充。这通常通过在光学系统中添加扩束镜来实现。可通过在轴向和径向扫描亚分辨率的固定荧光微珠，然后将荧光强度分布绘图并拟合为高斯曲线，以确定1/e²宽度，并与文献值进行比较，从而验证过填充是否恰当。

选择合适的监测和漂白功率也非常重要。用于漂白前后荧光监测的功率应足够低，以避免引起明显的漂白，但又要足够高，以获得良好的信噪比。漂白功率必须避免激发饱和。在双光子荧光漂白恢复（MP...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
钛宝石激光器	Newport Corp.	Mai Tai
普克尔斯盒	Conoptics	350-80
激光扫描显微镜	Olympus Corporation	Fluoview
短通二向色镜	Chroma Technology Corp.	670 DCSX-2P
光电倍增管	Hamamatsu Corp.	HC125-02
光子计数器	Stanford Research Systems	SR 400
多通道定标/平均器	Stanford Research Systems	SR 430
脉冲发生器	Stanford Research Systems	DG 535
FITC-BSA	Invitrogen	--