基于微流控流动小室的血小板黏附与聚集流动实验

摘要

血小板黏附级联反应发生在剪切流存在的条件下，而传统的（静态）孔板检测方法并未考虑这一因素。本文报道了一种利用微流控孔板形式模拟生理剪切流条件的血小板聚集检测方法。

摘要

血小板聚集是在血管损伤后内皮下细胞外基质暴露所引发的生理反应。血小板黏附级联过程发生在剪切流存在的条件下，而传统的静态孔板检测方法无法模拟这一关键因素。本文介绍一种利用微流控孔板平台模拟生理剪切流条件的血小板聚集检测方法。通过气动泵主动灌注，将细胞外基质蛋白（如I型胶原或血管性血友病因子）沉积于微流控通道内。随后用缓冲液洗涤并封闭基质蛋白，以准备通道用于血小板相互作用。将经荧光染料标记的全血以不同流速灌注通过通道，以诱导血小板活化与聚集。在流体实验前可加入血小板聚集抑制剂，以生成IC50剂量反应数据。 关键词：血小板聚集，微流控，剪切流，I型胶原，血管性血友病因子，全血，IC50，流体实验

方案

第1部分：BioFlux板微流控通道的制备。

1. 在运行流体通道实验之前，需要使用目标蛋白对微流控通道进行包被。本实验中将使用 I 型胶原蛋白。每个通道均有一个入口孔和一个出口孔。对于该微流控板，通道的左侧孔为入口孔，右侧孔为出口孔。
2. 将 I 型胶原蛋白（5 mg/ml 原液）用 0.02 M 乙酸稀释至 200 μg/ml 的浓度。每条通道需使用 20 μl。使用移液器枪头轻轻吹打混匀。
3. 向每条待用通道中加入 20 μl 包被液。必须使用移液器将液体加入目标微流控通道对应的出口孔内侧穿孔中。避免引入气泡，不要将移液器中的空气完全排出。另设一条不加胶原蛋白的通道作为无胶原蛋白对照（用于黏附和聚集的阴性对照）。
4. 先用手拧紧接口上的 4 个螺丝，待全部初步固定后，使用扭矩扳手完全拧紧。当扭矩扳手达到最大紧固程度时会发出“咔哒”声提示。
5. 在 BioFlux 软件的手动模式下，从出口孔开始以 2 dyn/cm² 的剪切力对目标通道进行灌注。此时需观察相对应的入口孔内侧穿孔是否被液体充满，此过程需数分钟。可通过显微镜低倍物镜（4X）观察入口孔，或手持微流控板从底部观察入口孔。应首先看到一滴微小液体缓慢填充内侧穿孔。一旦入口内侧穿孔被完全充满，立即在软件中点击“停止”以终止灌注。
6. 将微流控板在室温下孵育 1 小时。
7. 移除接口，在出口孔中加入 1 ml PBS（含 Ca²⁺/Mg²⁺）。从出口孔开始以 2 dyn/cm² 进行灌注，持续 10 分钟。停止灌注并移除接口。
8. 从入口和出口孔中移除多余的 PBS——切勿移除填充在内侧穿孔中的液体。使用封闭液（含 0.5% v/v BSA 的 PBS（含 Ca²⁺/Mg²⁺））对通道进行封闭。向每个待用的出口孔中加入 1 ml 封闭液，并从出口孔以 2 dyn/cm² 进行灌注，持续 10 分钟。停止灌注并移除接口。完成上述步骤的通道可在当天内使用。
9. 在加入血液前，移除通道两侧孔中的液体，但保留内侧穿孔中的液体。

第2部分. 使用GPIIb/IIIa抑制性抗体处理血液。

1. 在胶原蛋白于通道中孵育的同时，需准备全血。处理人血时，应遵守所在机构规定的生物安全规范。
2. 应使用采集后3小时内、以柠檬酸钠抗凝剂采集的健康空腹个体新鲜人血。
3. 通过加入4μM钙黄绿素AM（calcein AM）来制备血液。将钙黄绿素AM用DMSO配制成4mM的储存液，并按1/1000（v/v）的比例加入血液中，轻轻颠倒混匀。
4. 将标记了钙黄绿素AM的血液每管1 ml分装至10个1.5 ml微量离心管中。按所需稀释比例向每管加入GPIIb/IIIa抑制性抗体（IgG的分子量约为150 kDa）。示例稀释梯度为从1200 nM至9 nM，并包括无抗体对照组和无关抗体对照组。理想的抑制阳性对照是利利亚公司（Eli Lilly）生产的ReoPro（abciximab），使用浓度为20 μg/ml。 轻轻颠倒混匀。
5. 室温孵育1小时，每10分钟轻轻颠倒混匀一次。

第3部分：在BF1000工作站上运行流体池实验。

1. 首先，必须在 BioFlux 控制模块中设置一个自动化程序。对于 I 型胶原，应设置一个从出口孔开始施加 10dyn/cm² 剪切力并持续 10 分钟的程序。此时，还应使用 BF1000 工作站设置数据采集参数，包括通道位置、FITC 波长下的图像采集以及时间间隔信息。建议在总共 10 分钟的时间内，每 30 秒使用 10 倍物镜对每个通道的 3 个视野进行一次图像采集。
2. 迅速操作，将每种条件下的 500 µL 预备血液分别加入不同的预备通道中。将未加抗体的对照血液加入一个涂有 I 型胶原的通道和一个仅封闭的通道中。
3. 将接口放置在微流控板上。
4. 将微流控板放置在 BF1000 工作站显微镜上，并将接口夹紧固定。
5. 执行微流控板加载调整。同时，移动载物台至含有血液的某一孔位，设置 FITC 图像采集参数（如曝光时间、增益等）。
6. 在 BioFlux 蒙太奇软件中启动采集，以同时开始流体剪切和图像采集。
7. 从 BF1000 工作站上取下微流控板，并根据机构规定处理废弃微流控板。

第4部分：代表性结果。

本文介绍了在微流控通道中进行血小板黏附和聚集的实验方案。该方案还包括使用血小板聚集抑制剂抗GPIIb/IIIa进行处理。利用BioFlux系统中包被了胶原的微流控通道，预期在未经处理的对照血液样本中随时间推移出现明显的血栓形成，而在未包被的通道中则无血栓形成。在最近一次实验中，对照条件下血小板聚集体的平均面积为2000μm²。
图1.

活化的GPIIb/IIIa是介导血小板-血小板相互作用及血栓稳定的关键因子¹。与胶原结合可激活GPIIb/IIIa复合物，从而引发这一反应²。在施加剪切力前，预先与抗GPIIb/IIIa抗体孵育1小时，应可观察到血栓体积减小以及血栓形成频率降低。在10 dyn/cm²条件下通常可观察到剂量依赖性反应。
图2.

该抑制剂在10 dyn/cm²条件下的IC₅₀值为17 nM。与无抗体对照相比，该供体在10 dyn/cm²条件下的最大抑制率为11%。

尽管本实验方法采用了特定的细胞外基质蛋白和特定的血小板聚集抑制剂，但该方案可扩展应用于其他包被物质、其他细胞类型以及其他细胞黏附实验中的抑制剂。此类实验成功的关键因素包括：避免微流控通道中产生气泡，使用正确的稀释液对所有试剂进行准确稀释，以及为所有试剂提供适当的孵育条件。

讨论

尽管本实验方法使用了特定的细胞外基质蛋白和特定的血小板聚集抑制剂进行演示，但该方案可扩展应用于其他包被物质、其他细胞类型以及其他用于细胞黏附实验的抑制剂。此类实验成功的关键因素包括：避免微流控通道中产生气泡，使用正确的稀释液对所有试剂进行准确稀释，以及为所有试剂提供适当的孵育条件。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牛I型胶原蛋白	试剂	Invitrogen	A1064401	可使用其他来源的I型胶原蛋白
含Ca/Mg的PBS	试剂	Invitrogen	14040-117
牛血清白蛋白（BSA）	试剂	EMD Millipore	EM-2930 Bottom of Form	可从VWR购买
钙黄绿素AM	试剂	Invitrogen	C1430	也可使用BD公司的钙黄绿素AM
BioFlux 1000系统	试剂	Fluxion Biosciences	联系公司
BioFlux板	试剂	Fluxion Biosciences	900013
抗GPIIb/IIIa抗体	试剂	Abcam	ab33407	另一个货号为ab15021
ReoPro	试剂	Eli Lilly		凭处方供应