开发了一种微流控胰岛灌注装置，用于评估多个胰岛的动态胰岛素分泌，同时进行钙离子内流和线粒体膜电位变化的荧光成像。
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摘要
摘要
一种用于评估多个胰岛动态胰岛素分泌并同时进行钙离子内流及线粒体膜电位变化荧光成像的微流控胰岛灌流装置被开发出来。该装置由三层结构组成：第一层包含一系列微尺度孔阵列（直径500 μm，深度150 μm），可在灌流条件下固定胰岛并最大化胰岛暴露的表面积；第二层包含一个圆形灌流腔室（深3 mm，直径7 mm）；第三层包含一条在注入灌流腔室前呈扇形展开的进样混合通道（宽2 mm，长19 mm，高500 μm），以优化进入灌流腔室前的混合效率。此外，文中还展示了在微流控灌流网络中生成多种葡萄糖浓度梯度（包括线性、钟形和方形梯度）的方法。
方案
A. 三层微流控灌注装置的微加工
底部微孔主程序（150 μm 深孔）
- 如有需要，使用剃刀清洁晶圆。依次用丙酮、甲醇和异丙醇（IPA）清洗。在50瓦功率下进行30秒的等离子体处理。
- 以2000 rpm转速旋涂SU8-100。[步骤1：500 rpm，10秒，加速100 rpm/s；步骤2：2000 rpm，30秒，加速300 rpm/s]。
[注意：旋涂SU8后不得用镊子夹持晶圆] - 将晶圆在65 °C下预烘20分钟，然后在95 °C下烘烤50分钟。
- 通过所需掩模版将晶圆暴露于紫外光下。对于150 μm高度的结构，曝光剂量为650 mJ/cm2。
- 曝光后，将晶圆在65 °C下烘烤1分钟，然后在95 °C下烘烤12分钟。
- 将晶圆在SU8显影液中显影15分钟。
微通道母版方案（500 μm 深孔）
- 如有需要，使用剃刀清洁晶圆。依次用丙酮、甲醇和异丙醇（IPA）清洗。在50瓦功率下进行等离子处理30秒。
- 以1000 rpm转速旋涂SU8-2150。[第一步：500 rpm，10秒，加速100 rpm/s；第二步：1000 rpm，30秒，加速300 rpm/s]。
- 将晶圆在65 °C下预烘15分钟，随后在95 °C下烘烤2小时30分钟。
- 通过所需掩模版将晶圆暴露于紫外光下。对于650 μm高度的结构，曝光剂量为685 mJ/cm2。
- 曝光后，将晶圆在65 °C下后烘5分钟，在95 °C下后烘35分钟。
- 在SU8显影液中显影晶圆20–30分钟。
聚二甲基硅氧烷（PDMS）溶液的制备
- 通过充分混合10份硅弹性体与1份标准Sylgard 184试剂盒中的固化剂，制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）溶液。
- 使用真空干燥器去除混合过程中在PDMS溶液中产生的气泡。
- 将无气泡的PDMS溶液缓慢滴加到SU8模具以及用于第三层的空培养皿上。
- 将热板温度设定为75 °C，并在此温度下固化PDMS 2小时。
- 使用合适尺寸的打孔器冲出入口、出口和交换孔。
- 使用手持式等离子体设备将各层在玻璃载片（厚度0.1 mm）上键合在一起。
B. 实验装置
- 通过微装置流过70%乙醇以进行灭菌，随后用去离子水冲洗以去除乙醇。再灌注50 ml含0.5% BSA的溶液，以防止胰岛素非特异性吸附到微通道壁上。
- 通过与注射泵通信的LabView软件测试葡萄糖梯度及其他相关梯度，确保梯度稳定。
- 将25–30个鼠胰岛在含2 mM葡萄糖的Krebs-Ringer缓冲液（KRB）中，于37 °C孵育30分钟，孵育液中加入5 μM Fura-2/AM（钙离子指示剂，Molecular Probes，CA）和2.5 μM Rhodamine 123（Rh123，线粒体膜电位指示剂，Sigma，MO）。
- 通过入口端口，用移液器小心地将鼠胰岛装入微流控灌注装置中。
- 使用Tygon管和Y型连接器将入口连接至注射泵，出口连接至组分收集器，从而构建微流控系统。装置置于显微镜载物台的加热板（37 °C）上，同时入口管路在加热板上加热，以维持腔室和溶液温度在37 °C。
- 装置设置完成后，立即用含2 mM葡萄糖的KRB对鼠胰岛进行灌注10分钟，随后进行葡萄糖梯度灌注（2 mM → 25 mM），持续25分钟。
- 使用SimplePCI软件每15秒采集并分析一次延时图像。同时，利用组分收集器每分钟收集一次灌注液，用于通过ELISA试剂盒分析胰岛素分泌情况。
代表性结果
小鼠胰岛采用2-25 mM葡萄糖线性梯度进行灌流。如图1所示，钙离子内流和胰岛素分泌在灌流约13分钟后被触发，此时葡萄糖浓度为6 mM。线粒体电势的变化如预期般更早出现，约在11分钟时即可观察到。该数据表明，利用此微流控网络来表征胰岛生理功能具有显著优势。
图1. 胰岛细胞刺激后的生理反应。
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讨论
传统的胰岛灌流系统（宏观和微观尺度）存在一些局限性，包括系统设置和设计复杂、技术要求高，以及难以在系统中创建用户自定义的化学梯度。本文所述的微流控灌流系统通过简化的结构设计和制造工艺克服了这些局限。更重要的是，该系统可与荧光成像方法相结合，成为研究胰岛生理学的独特工具。该系统在荧光信号检测中表现出高信噪比以及优异的空间-时间分辨率。当前的原型装置还能在单个芯片上容纳多个灌流单元，并提供多种类型的微环境，适用于广泛的应用场景。
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致谢
本工作得到了美国大学妇女协会（AAUW）国际奖学金对 Adeola Adewola 的资助、美国国立卫生研究院/国家研究资源中心（NIH/NCRR，项目编号 U42RR023245）对 Jose Oberholzer 的资助，以及芝加哥糖尿病项目的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 60ml 注射器 | BD Biosciences | ||
| Fura-2 荧光染料 | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| 罗丹明123 荧光染料 | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | ||
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | ||
| 30" 硅胶管 | Cole-Parmer | 1/16 x 1/8in | |
| 1.5ml Eppendorf 离心管 | Fisher Scientific | ||
| Y型连接头 | Cole-Parmer | 1/16” & 4mm | |
| 注射器连接头 | Cole-Parmer | 雌性鲁尔接头 1/16” | |
| 直通连接头 | Cole-Parmer | 1/16” | |
| 弯头连接头 | Cole-Parmer | 1/16” | |
| 哈佛注射泵 | Harvard Apparatus | ||
| 灌流装置 | |||
| 加热板 | PMC | ||
| 温度计 | Omega Engineering, Inc. | ||
| 组分收集器 | Gibson | ||
| 移液器 | Fisher Scientific | ||
| 倒置落射荧光显微镜 | Olympus Corporation | IX71 | |
| 电荷耦合器件 | QImaging | Retiga-SRV, Fast 1394 |
参考文献
- Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets. Lab Chip. 9, 97-106 (2009).
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