用于富集循环有核细胞的自动化微流控血液裂解方案

摘要

开发了一种自动化的微流控装置，通过红细胞裂解法从外周血中富集循环有核细胞，确保在无细胞损失的情况下分离出高质量的样本。

摘要

本报告详细介绍了自动化微流控血液裂解装置的操作流程。循环有核细胞（CNCs），包括白细胞和内皮细胞，为评估个体免疫状态提供了理想平台。该微流控方案可在无选择性细胞丢失及人为操作导致样本制备差异的情况下实现CNCs的富集。简而言之，该流程包括装置制备、样本采集、设备设置以及将血液通过微流控腔室。在装置内，全血在50微米×150微米的微流控通道中与去离子水快速混合约10秒，在低渗条件下红细胞迅速裂解。通道底部的鱼骨状结构可确保细胞充分混合并暴露于均一环境中。剩余细胞在装置出口处恢复等渗状态，经2%多聚甲醛固定后，通过离心分离红细胞碎片与CNCs，最终重悬于流式缓冲液中，用于后续流式细胞术染色与分析。结果显示，流式细胞术散点图清晰，CNCs群体得以有效保留。该装置及操作流程的重要意义在于通过分析CNCs群体，促进对疾病发病机制的研究与理解。因此，本微流控方案展现出自动化、高效性与操作简便的优势。 微流控，血液裂解，循环有核细胞，流式细胞术，自动化样本处理，低渗裂解，鱼骨结构，多聚甲醛固定

方案

第1部分：微流控装置的制备

采用标准的光刻技术，利用路易斯维尔大学洁净室中的设备制备了微流控裂解装置的硅质母模 [1]。使用 AutoCAD（Autodesk, Inc., San Rafael, CA）设计透明掩膜（Fineline Imaging, Colorado Springs, CO），用于生成通道的负向复制品。通过软光刻技术，利用弹性体聚二甲基硅氧烷（PDMS；Dow Corning, Midland, MI）从硅质母模上复制出微流控裂解装置。将带有复制通道的弹性体剥离后，使用20号针头（Small Parts, Miramar, FL.）打孔以形成通道进样口。随后，将PDMS芯片通过氧等离子体处理不可逆地键合至载玻片上，并用于实验测试。

第2部分. 裂解装置操作方案

微流控装置制备并测试完成后，即可开始进行红细胞裂解实验。以下部分详细说明了该微流控装置的操作流程。

2.1 样品采集

1. 使用含肝素作为抗凝剂的两支2 ml绿色头盖真空采血管，从患者的前臂前侧肘正中静脉采集4毫升血液样本。
2. 弃去第一支2 ml试管，因其可能含有脱落的成熟内皮细胞（假阳性）。
3. 将第二支试管轻轻上下颠倒混匀，使肝素与血液充分混合，并立即置于冰上保存。

讨论

已有文献报道了一种自动化的微流控血液裂解方案。该方案中包含若干关键步骤需特别注意。在第 P.2.1 节中，重要的是应弃去采集到的第一管血液，因为该样本中含有脱落的成熟内皮细胞，可能产生假阳性结果。同时务必在血液采集后一小时内完成样本检测。在第 P.2.2 节中对微流控装置进行预润洗时，必须首先彻底排除气泡。此外，在整个实验过程中更换注射器与针头连接时，应避免引入气泡。在第 P.2.4 节中用血液填充 1 ml 注射器时，必须先加入 1X PBS 缓冲液再加入血液，并始终保持注射器处于垂直状态，以防止两种溶液混合。在启动推动血液样本的注射泵之前，需确保大体积注射泵已开始运行，使系统达到全速状态。当样本完成在装置中的运行并经过离心后，应小心尽可能多地移除上清液（包括红细胞碎片），同时不扰动底部的白色沉淀物。最后，在第 P.2.5 节中，应遵循试剂生产商提供的操作说明，以确保向 100 μL 样本中加入正确浓度的抗体。

微流控方案在临床研究中具有广泛的应用前景。通过检测个体循环无核细胞（CNCs）的免疫状态，可获得有关健康状况的重要信息，并有助于疾病的诊断及对发病机制的理解。相较于涉及.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Sylgard 184 硅胶弹性体基础剂	Dow Corning
Sylgard 184 硅胶弹性体固化剂	Dow Corning
30 号针头注射器	Small Parts, Inc.	NE-301PL-25
Tygon 管道（内径 .010"）	Small Parts, Inc.	TGY-010
20 号针头注射器	Small Parts, Inc.	NE-201PL-25
注射泵（Harvard PHD 22/2000）	Harvard Apparatus	702000
注射泵（Harvard Pico Plus）	Harvard Apparatus	702213
流式细胞术管	DB Biosciences	352052
抗体染色剂	DB Biosciences
1.5 ml Eppendorf 管	Fisher Scientific	05-402-25
50 ml 管	Fisher Scientific
1 ml 注射器	Fisher Scientific
30 ml 管	Fisher Scientific
多聚甲醛（PFA）	Fisher Scientific
牛血清白蛋白（BSA）	Fisher Scientific
10X PBS	Fisher Scientific