开发了一种自动化的微流控装置，通过红细胞裂解法从外周血中富集循环有核细胞，确保在无细胞损失的情况下分离出高质量的样本。
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本文内容
摘要
摘要
本报告详细介绍了自动化微流控血液裂解装置的操作流程。循环有核细胞（CNCs），包括白细胞和内皮细胞，为评估个体免疫状态提供了理想平台。该微流控方案可在无选择性细胞丢失及人为操作导致样本制备差异的情况下实现CNCs的富集。简而言之，该流程包括装置制备、样本采集、设备设置以及将血液通过微流控腔室。在装置内，全血在50微米×150微米的微流控通道中与去离子水快速混合约10秒，在低渗条件下红细胞迅速裂解。通道底部的鱼骨状结构可确保细胞充分混合并暴露于均一环境中。剩余细胞在装置出口处恢复等渗状态，经2%多聚甲醛固定后，通过离心分离红细胞碎片与CNCs，最终重悬于流式缓冲液中，用于后续流式细胞术染色与分析。结果显示，流式细胞术散点图清晰，CNCs群体得以有效保留。该装置及操作流程的重要意义在于通过分析CNCs群体，促进对疾病发病机制的研究与理解。因此，本微流控方案展现出自动化、高效性与操作简便的优势。
微流控，血液裂解，循环有核细胞，流式细胞术，自动化样本处理，低渗裂解，鱼骨结构，多聚甲醛固定
方案
第1部分：微流控装置的制备
采用路易斯维尔大学洁净室中的设备，通过标准光刻技术制备微流控裂解装置的硅质母模[1]。使用AutoCAD（Autodesk, Inc., San Rafael, CA）设计透明掩膜版（Fineline Imaging, Colorado Springs, CO），用于生成通道的负向复制品。利用弹性体聚二甲基硅氧烷（PDMS；Dow Corning, Midland, MI）通过软光刻技术，以硅母模制备微流控裂解装置。将复制有通道结构的弹性体脱模，并使用20号针头（Small Parts, Miramar, FL.）打孔以形成通道进出口。通过氧等离子体处理，将PDMS芯片不可逆地键合至载玻片表面，并进行实验测试。
第2部分. 裂解装置操作方案
在微流控装置制备和测试完成后，即可开始进行红细胞裂解实验。以下部分详细说明了该微流控装置的操作流程。
2.1 样品采集
- 使用两支2 ml绿色盖子的真空采血管，从患者的前臂前侧肘正中静脉采集4毫升血液样本，并以肝素作为抗凝剂。
- 弃去第一支2 ml试管，因其可能含有脱落的成熟内皮细胞（假阳性结果）。
- 将第二支试管轻轻上下颠倒，使肝素与血液充分混匀；立即置于冰上保存。
- 取1 ml血液转移至1.5 ml Eppendorf管中。血液样本须立即处理（采集后一小时内完成）。
2.2 使用 PBS 预处理微流控装置
- 获取一个已键合到玻璃上的微流控装置。将外径略大的接入管路（Small Parts, Miramar, FL）压入进样口和出样口（图1）。
- 在每个进样口的管路上连接一根30号规格的注射器针头（Small Parts, Miramar, FL），以实现宏观到微观的接口连接。
- 用1 ml注射器吸取1X PBS缓冲液，并通过轻弹针头去除气泡。将装有PBS的1 ml注射器连接至微流控装置的进样口1。手动缓慢推动注射器，使溶液从进样口2流出，随后立即使用标准办公文件夹夹紧进样口2。
- 继续推动1X PBS，直至液体到达微流控装置的出口端口。当溶液从出口流出时，立即用另一个文件夹夹紧出口管路。
- 继续推动1 ml注射器，直至1X PBS从进样口3流出，并用另一个办公文件夹夹紧进样口3端口。此时，微流控装置已完成全部预填充。
图1. 装置示意图，显示各溶液的入口和出口。
2.3 注射泵和溶液的制备
- 校准泵的操作步骤如下：
- 对于大型 Harvard 注射泵（Harvard, PHD 22/2000 部件号 # 702000）：将直径参数设置为 22.5 mm，流速设置为 600 μl/min。
- 对于小型 Harvard 注射泵（Harvard, Pico Plus 部件号 # 702213）：将直径参数设置为 4.61 mm，流速设置为 20 μl/min。
- 用一个 30 ml 注射器吸取无菌去离子水。可通过直接从 50 ml 锥形管中抽取溶液完成。（请标记该注射器）
- 使用第 9 步所述方法，用第二个 30 ml 注射器吸取 2X 磷酸盐缓冲盐水（PBS）和 2% 多聚甲醛（PFA）。（请标记该注射器）
- 使用第 9 步所述方法，用 1 ml 注射器从 15 ml 锥形管中储存的分装液中吸取 1X PBS。
- 将装有 30 ml 去离子水的注射器连接至入口 2，将装有 30 ml 2X PBS 的注射器连接至入口 3（确保管路或微流控装置中未夹入气泡）。移除入口 2 和入口 3 以及出口管路上的夹子。将装有 1X PBS 的 1 ml 注射器连接至入口 1。为避免引入气泡，应先用液体充满注射器针头，再连接注射器，并轻弹针头以排除气泡。
2.4 红细胞裂解
- 按照以下说明将所有注射器安装到相应的哈佛泵上：
- 将两个 30 ml 注射器（一个装有无菌去离子水，另一个装有 2X PBS、2% PFA）一起安装到大型哈佛注射泵上。
- 将装有 1X PBS 的 1 ml 注射器安装到小型哈佛注射泵上。
- 将出口管路放入废液收集管（标记为“废液”的 50 ml 圆锥形离心管）中。
- 开启大型哈佛注射泵（装有两个 30 ml 注射器），运行一分钟。（确保设备和管路中无气泡且无泄漏）。
- 开启小型哈佛注射泵，并再运行一分钟。（确保设备和管路中无气泡且无泄漏）。停止泵运行。此时微流控装置已准备就绪，可供使用。
- 从小型哈佛注射泵上取下装有 1X PBS 的 1 ml 注射器。
- 获取血液样本后，用 1 ml 注射器吸取 0.05 ml 无菌 1X PBS，避免引入气泡；接着从 Eppendorf 管中吸取 0.5 ml 血液样本。（此时 1 ml 注射器中最终总体积为 0.55 ml 的血液与 1X PBS 缓冲液混合物。）注意：填充过程中保持注射器垂直，以避免 0.05 ml PBS 与血液过早混合。
- 将装有血液的注射器连接至入口 1，并小心安装到小型哈佛注射泵上（避免推动注射器使血液进入管路和装置），注射器应垂直固定于泵中。
- 将出口管路从“废液”管中移出，换上一个洁净的 50 ml 离心管，并将其置于冰桶中。
- 首先开启大型哈佛注射泵，运行 1 分钟。开始将出口流出的样本收集至 50 ml 离心管中。
- 开启小型哈佛注射泵。
- 当 1 ml 注射器中的血液样本完全通过装置后，停止两台泵。此过程大约需要 20 分钟。
- 在室温下以 350 × g 离心收集的样本 5 分钟，关闭刹车。
- 用移液器吸头从白色沉淀对侧吸取上清液。尽可能去除上清液，尤其是红细胞碎片，同时不扰动白色沉淀。
- 通过反复吹打，将样本重悬于 1 ml 流式缓冲液（1X PBS、1% BSA [牛血清白蛋白]、2% PFA）中。将样本转移至 1.5 ml Eppendorf 管中。
- 在室温下以 4 × g 微量离心 5 分钟。使用与之前相同的精度去除上清液。
- 通过涡旋振荡，将样本重悬于 1 ml 流式缓冲液中。
2.5 流式细胞术分析的准备工作
- 使用流式细胞术分析样品时，向流式细胞术管中加入 100 μl 样品。
- 向 100 μl 样品中加入指定抗体（确保浓度正确）。
- 将样品在 40 °C 下孵育 30 分钟。
- 流式细胞术检测前用流式缓冲液洗涤两次。洗涤步骤包括加入 250 μl 流式缓冲液，涡旋混匀，以 350 × g 离心 5 分钟，并通过一次倾倒动作去除流式细胞术管中的上清液。
- 将沉淀重悬于 250 μl 流式缓冲液中。样品即可用于流式细胞术分析。
代表性结果
全血已通过微流控裂解装置及后续处理流程，去除红细胞并富集循环有核细胞（CNCs）。理想结果应获得清晰的流式细胞术散点图，显示分离的CNC群体。下方图2和图3展示了未经红细胞裂解与经微流控流程红细胞裂解后的全血样本散点图对比，坐标轴为前向散射光（FSC）对侧向散射光（SSC）。可见微流控富集流程对于获得清晰的流式细胞术散点图至关重要。
图 2. 未经红细胞裂解处理的全血样本的流式细胞术散点图，横轴与纵轴分别为 FSC 和 SSC。
图 3. 经微流控红细胞裂解处理的循环有核细胞的流式细胞术散点图，以 FSC 和 SSC 轴标记细胞群体。区域 1（红色）代表淋巴细胞，区域 2（绿色）代表单核细胞，区域 3（蓝色）代表粒细胞，区域 4（紫色）尚未明确特征。
在必要时，通过移液器去除红细胞碎片也是该方案中的重要步骤。下图4所示散点图显示了过量的红细胞碎片。尽管其未像图2那样造成散点图的弥散，但在数据分析时仍需考虑红细胞碎片所增加的事件数。
图 4. 流式细胞术散点图，显示红细胞碎片，表现为第 5 区域（青色）中的事件聚集。
对特定抗体表型标志物进行染色也会产生特征性的结果。以下图示展示了三种不同白细胞群体的抗体表型染色结果：淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。图5展示了以CD3和CD4为坐标轴绘制的淋巴细胞群体。单核细胞和粒细胞分别在图6和图7中显示，其坐标轴分别为FSC与CD14、FSC与CD66b。
图 5. 流式细胞术散点图，显示以 CD3 和 CD4 为坐标轴的淋巴细胞。
图6. 流式细胞术散点图，显示以FSC和CD14轴标识的单核细胞。
图 7. 流式细胞术散点图，显示粒细胞在FSC与CD66b轴上的分布。
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讨论
已有文献报道了一种自动化的微流控血液裂解方案。该方案中包含若干关键步骤需特别注意。在第 P.2.1 节中，重要的是应弃去采集到的第一管血液，因为该样本中含有脱落的成熟内皮细胞，可能产生假阳性结果。同时务必在血液采集后一小时内完成样本检测。在第 P.2.2 节中对微流控装置进行预润洗时，必须首先彻底排除气泡。此外，在整个实验过程中更换注射器与针头连接时，应避免引入气泡。在第 P.2.4 节中用血液填充 1 ml 注射器时，必须先加入 1X PBS 缓冲液再加入血液，并始终保持注射器处于垂直状态，以防止两种溶液混合。在启动推动血液样本的注射泵之前，需确保大体积注射泵已开始运行，使系统达到全速状态。当样本完成在装置中的运行并经过离心后，应小心尽可能多地移除上清液（包括红细胞碎片），同时不扰动底部的白色沉淀物。最后，在第 P.2.5 节中，应遵循试剂生产商提供的操作说明，以确保向 100 μL 样本中加入正确浓度的抗体。
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致谢
本研究得到了华莱士·H·科尔特基金会转化研究早期职业奖的支持。感谢儿科血液学/肿瘤学的Tim Andrews在血液样本采集方面的帮助。同时感谢詹姆斯·格雷厄姆·布朗癌症中心流式细胞术核心实验室的Sam Wellhausen博士在流式细胞术样本检测方面的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Sylgard 184 硅胶弹性体基础剂 | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 硅胶弹性体固化剂 | Dow Corning | ||
| 30 号针头注射器 | Small Parts, Inc. | NE-301PL-25 | |
| Tygon 管道（内径 .010"） | Small Parts, Inc. | TGY-010 | |
| 20 号针头注射器 | Small Parts, Inc. | NE-201PL-25 | |
| 注射泵（Harvard PHD 22/2000） | Harvard Apparatus | 702000 | |
| 注射泵（Harvard Pico Plus） | Harvard Apparatus | 702213 | |
| 流式细胞术管 | DB Biosciences | 352052 | |
| 抗体染色剂 | DB Biosciences | ||
| 1.5 ml Eppendorf 管 | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| 50 ml 管 | Fisher Scientific | ||
| 1 ml 注射器 | Fisher Scientific | ||
| 30 ml 管 | Fisher Scientific | ||
| 多聚甲醛（PFA） | Fisher Scientific | ||
| 牛血清白蛋白（BSA） | Fisher Scientific | ||
| 10X PBS | Fisher Scientific |
参考文献
- White, W. Clinical application of microfluidic leukocyte enrichment protocol in mild phenotype sickle cell disease (SCD. Biomedical Microdevices. 11 (2), 477-483 (2009).
- Sethu, P. Continuous Flow Microfluidic Device for Rapid Erythrocyte Lysis. Anal. Chem. 76 (21), 6247-6253 (2004).
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