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使用Di-8-ANEPPS测量诱导膜电压

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DOI：

10.3791/1659

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2009年11月19日

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1Department of Biomedical Engineering, Faculty of Electrical Engineering, University of Ljubljana

本文内容

摘要

外加电场会在细胞膜上诱导产生电压，称为诱导膜电压（ΔΦ）。通过使用电位敏感染料di-8-ANEPPS，可以无创地测量ΔΦ。本视频展示了使用di-8-ANEPPS测量ΔΦ的实验方案。

摘要

将细胞置于外部电场中，会导致细胞膜附近细胞内外局部电荷重新分布，从而在膜上产生电压。该电压称为诱导膜电压（也称诱导跨膜电压或诱导跨膜电位差），用 ΔΦ 表示，仅在外部电场存在时出现。若细胞膜上存在静息电压，诱导电压会叠加于其上。通过使用一种电位敏感性荧光染料（如 di-8-ANEPPS），可非侵入性地观察细胞膜上 ΔΦ 的变化并测量其数值。di-8-ANEPPS 与细胞膜脂双层结合后会表现出强烈荧光，其荧光强度的变化与 ΔΦ 的变化成正比。本视频展示了使用 di-8-ANEPPS 测量 ΔΦ 的实验方案，并演示了细胞形状对 ΔΦ 幅值及空间分布的影响。

方案

第一部分：初步步骤

  1. 本实验使用中国仓鼠卵巢细胞系（CHO-K1）。将细胞以约 0.7×105 个细胞/ml 的密度接种于 Lab-Tek II 培养板（2 孔，每孔 4 cm2）（Nalge Nunc，德国）中，培养基为添加了 8% 胎牛血清、0.15 mg/ml L-谷氨酰胺、16 mg/ml 庆大霉素（均来自 Sigma-Aldrich，Steinheim，德国）以及 200 单位/ml Crystacillin（Pliva，萨格勒布，克罗地亚）的 HAM-F12 培养基，并在 37°C、5% CO2 条件下培养。 alternatively，也可将细胞接种于 #1 盖玻片（厚度 0.13 至 0.16 mm）上，玻片表面可预先涂覆多聚赖氨酸等细胞黏附剂。
  2. 将细胞置于培养基中孵育。孵育 2 至 4 小时后，细胞大致呈球形，但已牢固贴附于表面，仅有部分细胞膜接触基质。 alternatively，孵育 16 至 20 小时后，细胞完全贴壁，形态更为复杂，但大多数细胞尚未进入分裂期。
  3. 通过向 Invitrogen 原装瓶中的 5 mg di-8-ANEPPS 染料加入 843 μl DMSO（Sigma-Aldrich，Steinheim，德国）配制 10 mM 储存液。该储存液可在 4°C 冰箱中保存数月。实验开始前，需将溶液升温至 DMSO 结晶完全溶解。
  4. 某些细胞系可能需要使用Pluronic以促进染料掺入细胞膜。Pluronic可购自20% DMSO储存液（F-127，Invitrogen，尤金，俄勒冈州，美国），或通过将Pluronic溶解于DMSO中自行配制相同浓度的储存液。Pluronic储存液可室温保存。

第二部分：用 di-8-ANEPPS 负载细胞

  1. 在1.5 ml的Eppendorf管中，将3 μl的10 mM di-8-ANEPPS与2.5 μl的20% pluronic溶于1 ml Spinner改良型最低必需培养基（无钙版本）SMEM（培养基M8167或M4767，Sigma-Aldrich，德国施泰因海姆）中。由此制得的“负载溶液”含有约30 μM di-8-ANEPPS和0.05% pluronic。对于其他类型的细胞，可使用其原代培养基替代SMEM。
  2. 将Lab-Tek培养皿中的培养基更换为上述负载溶液，并将培养皿置于冰箱中，在4°C下孵育10分钟。在此温度下，染料通过质膜的内化过程将被显著抑制。
  3. 染色完成后，用纯SMEM轻柔洗涤2至3次，以去除多余的染料。
  4. 在培养皿中保留1.5 ml SMEM。

第三部分：实验与图像采集

  1. 使用配备油浸物镜（×63，NA 1.4）、单色器（Polychrome IV，Visitron，德国）和冷却CCD相机（VisiCam 1280，Visitron，德国）的荧光显微镜（本实验使用Zeiss AxioVert 200，Zeiss，德国）观察细胞。图像通过MetaFluor 7.1.1采集，并在MetaMorph 7.1.1（均来自Molecular Devices，Downingtown，PA，美国）中进行处理，但也可使用其他类似的采集软件。在采集软件中将激发波长设为490 nm，并为ANEPPS选择合适的发射滤光片，例如中心波长为605 nm的带通滤光片（605/55m，二向色镜565 DCXR，Chroma，Rockingham，VT，美国）。若无单色器，可改用中心波长为490 nm的激发滤光片。
  2. 将含有细胞的培养室置于显微镜载物台上，将电极放置在培养室底部并连接至脉冲发生器。培养基应覆盖电极。
  3. 为维持细胞活性并减少发热，脉冲应具有足够低的幅值和短的持续时间。本实验中，使用直流电压源和自制的微处理器控制开关装置产生幅值为35 V、持续时间为50 ms的方波脉冲（足够低以避免电穿孔）。也可使用商用脉冲发生器，如33210A（Agilent，Santa Clara，CA，美国）连接放大器，或商用刺激器如S88（Grass，West Warwick，RI，美国）。脉冲施加到两根平行的Pt/Ir丝状电极上，电极直径为0.8 mm，间距为4 mm，从而在电极间形成约88 V/cm的电场，诱导产生ΔΦ。本实验所用电极间精确的电场分布已在其他文献中描述[1]。
  4. 找到目标细胞，施加单个电脉冲或一系列脉冲。对每个脉冲，采集两幅荧光图像：一幅在脉冲施加前立即采集（对照图像），另一幅在脉冲施加期间采集（脉冲图像）。由于di-8-ANEPPS响应较弱，荧光变化肉眼难以分辨，仅在图像处理后才变得明显。脉冲施加必须与图像采集同步，此功能由采集软件提供。为避免光漂白和可能的加热，可将照明时间限制在脉冲持续期间。

第四部分：图像处理与分析

  1. 在 MetaMorph 软件中打开图像。对每个脉冲，分别从对照图像和脉冲图像中减去背景。
  2. 选择一个细胞，并设置感兴趣区域，使其与细胞膜相对应。测量该区域内对照图像和脉冲图像的荧光强度，并将数值导入电子表格。
  3. 对每个脉冲，用脉冲数据减去对照数据，再将结果除以对照数据，得到相对荧光变化值。若施加了一系列脉冲，则可对每个脉冲所得的相对荧光变化值取平均，以获得更可靠的测量结果。
  4. 利用校准曲线将相对荧光变化转换为 ΔΦ。该曲线的粗略估计值可从文献中获得，但为了更高的准确性，需针对每个特定实验装置进行测量。在本实验所用的细胞和装置中，荧光强度每降低 6%，对应 ΔΦ 增加 100 mV [2]。
  5. 最后，使用图形软件（如 Excel（Microsoft Corp.，美国华盛顿州雷德蒙德）、Sigma Plot（Systat Software Inc.，美国加利福尼亚州圣何塞）或 Origin（OriginLab Corp.，美国马萨诸塞州北安普顿））将电压对相对弧长作图。也可使用适当的滤波器（如移动平均滤波器）对曲线进行平滑处理。

讨论

诱导膜电位（跨膜电位）ΔΦ 的测量在多种实验场景中具有重要意义，例如电压门控膜通道研究、动作电位传播、心肌细胞刺激或细胞膜电穿孔等[3, 4, 5, 6, 7]。对于形状简单的细胞，ΔΦ 可通过解析方法计算。例如，对于球形细胞，ΔΦ 可由 Schwan 方程给出，该方程指出膜电位与电场强度和细胞尺寸成正比，并沿膜面呈余弦函数分布[8, 9]。对于更复杂的细胞形态，ΔΦ 可能显著偏离余弦分布，必须通过数值模拟（借助计算机）[2, 10, 11] 或使用电位敏感性染料进行实验测定[12, 13, 14, 15]。

用于此目的的电位敏感染料之一是di-8-ANEPPS（di-8-丁基-氨基-萘基-乙烯-吡啶基-丙基-磺酸盐），这是一种响应速度快的染料，其激发和发射光谱随膜电位变化而变化，从而可对细胞膜上ΔΦ的变化进行非侵入性观察，并测量其数值。在本视频中，我们展示了一种利用di-8-ANEPPS测定ΔΦ的实验方法。

该染料由康涅狄格大学的 Leslie Loew 教授及其同事开发[13, 14]，属于快速响应染料类别。di-8-ANEPPS 在水中无荧光，当其插入细胞膜的脂质双分子层后会表现出强烈的荧光。膜电位变化（ΔΦ）会导致染料分子内电荷分布发生改变，从而引起其荧光光谱特征和荧光强度的相应变化。di-8-ANEPPS 的荧光强度与 ΔΦ 的变化成正比；在 −280 mV 至 +250 mV 的电压范围内，该染料的响应呈线性关系[4, 16]。然而，由于染料荧光变化幅度相对较小、膜染色不均以及染料内化等问题，di-8-ANEPPS 不太适用于膜电位绝对值的测量（例如静息膜电位），尽管也有相关研究报道[17]。但它适用于检测较大的膜电位变化，例如在外界电场作用下非兴奋性细胞中诱导产生的膜电位变化[12, 13]，或兴奋性细胞中的动作电位[4, 5]。虽然本文未采用，但 di-8-ANEPPS 还可通过荧光激发[18]或发射[19]的比率测量法来测定 ΔΦ，这种方法可提高响应灵敏度，并减轻上述不利影响。由于 di-8-ANEPPS 能对膜进行染色，因此也可直接用作膜标记物[2]。

该染料的缺点之一是容易发生光漂白，因此应避免长时间暴露于强光下。染料的校准可通过以下两种方法进行：（i）使用钾离子载体缬氨霉素，并在外部介质中设置一系列不同的钾离子浓度[2,18]，或（ii）采用膜片钳技术在电压钳模式下进行[17]。

最后，通过测量球形细胞和形状更复杂的细胞的ΔΦ，视频展示了细胞形状对ΔΦ幅度及其空间分布的影响。对于球形细胞，ΔΦ接近于余弦分布，与Schwan方程的预测一致；而对于形状更复杂的细胞，ΔΦ的空间分布则更为复杂[20]……

致谢

本工作由斯洛文尼亚研究署资助，项目编号为 Z2-9229，项目计划编号为 P2-0249。本视频是斯洛文尼亚卢布尔雅那大学电气工程学院每两年举办一次的“电穿孔技术与治疗”科学研讨会及研究生课程的补充材料。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
di-8-ANEPPSInvitrogenD-3167电位敏感性荧光染料
pluronicInvitrogenP3000MP钾离子载体
DMSOSigma-AldrichD2650
SMEMSigma-AldrichM8167 或 M4767最低必需培养基的旋转瓶改良型
Ham-F12Sigma-AldrichN4888培养基
胎牛血清Sigma-AldrichF4135
L-谷氨酰胺Sigma-AldrichG7513
crystacillinPliva625110抗生素
庆大霉素Sigma-AldrichG1397抗生素
Lab-Tek IINalge Nunc international155379腔室
直流电压电源Elektro-Automatik
微处理器控制开关装置定制
电极定制Pt/Ir

参考文献

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