用于电生理研究的新生小鼠脊髓分离示例。
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摘要
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摘要
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新生小鼠脊髓是研究神经回路发育和运动功能的模型。我们演示了用于运动研究的脊髓分离技术以及记录浴液人工脑脊液的制备方法。脊髓分离后，可将腹侧神经根连接至记录电极，以记录腰段脊髓内中枢节律生成电路的电生理信号。
方案
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1. 配制人工脑脊液（aCSF）1。首先配制2升不含镁和钙的10倍浓缩aCSF储备液。所列试剂浓度单位为毫摩尔。目录编号参考Sigma/Aldrich公司产品。
| 2升10倍浓度人工脑脊液（不含Mg或Ca） | |||
| 试剂 | 毫摩尔浓度（mM） | 每2升所需克数（g/2L） | 货号 |
| KCl | 40 | 5.96 | P-9333 |
| NaCl | 1280 | 149.61 | S-7653 |
| NaHCO3 | 210 | 35.28 | S-6297 |
| NaH2PO4 | 5 | 1.38 | S-9638 |
| 葡萄糖 | 300 | 108.12 | D-9434 |
| 加蒸馏水至2升 | |||
我们还将在50 mL水中配制1 M的MgSO4和CaCl2溶液，以便在不同实验之间调整摩尔浓度，并确保钙保持在溶液中。
| 1 M 钙和镁储备液 | |||
| 试剂 | M | g/50 mL | 货号 |
| CaCl2 | 1 | 7.35 | C-5080 |
| MgSO4 | 1 | 12.33 | M-5921 |
在添加钙之前，必须用碳酰气（95% O2 / 5% CO2）对aCSF溶液进行通气以降低pH值，否则钙会发生沉淀。
| 1 升 aCSF | |
| 试剂 | 体积 |
| 10X aCSF | 100 mL |
| 1M CaCl2 | 1 mL（用于解剖）或 2 mL（用于记录） |
| 1M MgSO4 | 1 mL |
| 加入约 800 mL 蒸馏水，通入碳合气（carbogen）2 分钟后，再加入钙离子 | |
| 用蒸馏水定容至 1 L。 | |
使用前后应冲洗泵、管路和解剖皿。
解剖
解剖过程中，应持续用碳氧混合气体（carbogen）对含有1 mM钙离子的aCSF进行通气。aCSF可通过虹吸方式从试剂瓶流入解剖皿，再通过泵从解剖皿返回试剂瓶或排入废液。我们使用表面涂有弹性体（Sylgard，Dow Corning）的培养皿进行解剖操作。
用锋利的剪刀迅速将新生小鼠断头，并用剪刀在腹侧胸腹部做一开口。随后去除内脏。将去内脏的小鼠用人工脑脊液（aCSF）冲洗。然后用昆虫针穿过前肢和尾基部，将小鼠固定在解剖皿中。
通过进行腹侧椎板切除术来移除脊柱。用小型镊子夹住脊柱，将小型剪刀的一侧刀片插入骨性脊柱后方紧邻处。在轻柔抬起骨性脊柱的同时，依次切断一侧和另一侧的椎板。沿脊柱全长重复此操作。
通过沿脊髓两侧剪切，切断脊神经根并剪开包绕脊髓的脑膜，从而取出脊髓。我们先在左右两侧剪开，然后剪断附着在脊髓背侧的脑膜以游离脊髓。分离出的脊髓随后被固定在培养皿中靠近人工脑脊液（aCSF）入口的位置，以便在继续解剖其他动物时确保良好的氧供。
然后使用小勺或刮刀将分离的脊髓转移至记录皿中。此处用含氧的2 mM钙 aCSF 灌流组织。将脊髓固定在涂有弹性体的记录皿中，并使用显微操作器移动细胞外全根吸电极靠近神经根。当电极尖端接近游离的神经根末端时，施加轻柔的负压，将神经根吸入吸电极内。此过程可重复进行，以同时记录多个神经根的信号。
图1. 断头与去脏。 A. 用锋利的剪刀迅速将小鼠断头。根据切割位置的不同，可获得不同程度的脑干组织。B. 将剪刀的一侧刀片插入断头所形成的胸腔开口中，剪开腹侧胸廓和腹部直至尾部基底。取出内脏并用aCSF冲洗。
图2. 脊柱的去除。 A. 将剪刀的左刀片插入脊髓右侧脊柱与脊髓之间的间隙，剪断脊髓腹侧的骨骼；然后将剪刀的右刀片插入脊髓左侧脊柱与脊髓之间的间隙，进行剪切。B. 在轻柔牵拉脊柱的同时重复此操作。操作时应保持剪刀角度较低，避免刺破脊髓。
图3. 脊髓的去除。 A. 将剪刀的左刀片插入脊髓与脊髓右侧骨骼之间的间隙，剪断位于脊髓外侧的脊神经根和脑膜。然后将剪刀的右刀片插入脊髓与脊髓左侧骨骼之间的间隙，剪断位于脊髓外侧的脊神经根和脑膜。B. 最后，轻轻提起脊髓头端，剪断连接背侧脊髓与椎板的脑膜。操作时应保持剪刀角度较低，避免刺破脊髓。不要在过于靠近脊髓的位置剪断神经根。
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讨论
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分离的新生脊髓为研究神经系统发育提供了一种可行的方法1,2。在新生啮齿类动物腰段脊髓中，中枢模式发生器回路可在神经递质存在的情况下产生拟态行走活动。这种拟态行走表现为节律性活动增强，即频率为0.2至0.5 Hz的簇状放电。这些放电活动在脊髓纵向上呈现左右交替模式，并在同侧L2与L5节段之间形成屈肌-伸肌交替放电。已有研究表明，多种小鼠基因突变可导致行为异常3-5。阐明脊髓神经回路在发育过程及遗传干扰下的改变机制，将有助于推动对中枢神经系统其他部位神经回路的研究。
值得注意的是，目前有几种常规使用的标准 aCSF 溶液。以下是常用 aCSF 配方的对照表。
表1：常用aCSF配方
| 实验室 | aCSF（人工脑脊液）成分（单位：mM） |
| Pfaff, O’D... |
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披露
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动物护理
动物实验均依照索尔克生物研究所 AIACUC 制定的指南与规定进行。
动物实验均依照索尔克生物研究所 AIACUC 制定的指南与规定进行。
致谢
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Samuel L. Pfaff 是索尔克生物研究所基因表达实验室的教授，同时也是霍华德·休斯医学研究所的研究员。本工作由克里斯托弗和丹娜·里夫基金会资助。索尔克研究所多媒体资源部门的 Joe Belcovson、Kent Schnoeker 和 Mike Sullivan 在摄影和编辑方面提供了协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| KCl | P-9333 | ||
| NaCl | S-7653 | ||
| NaHCO3 | S-6297 | ||
| NaH2PO4 | S-9638 | ||
| 葡萄糖 | D-9434 | ||
| CaCl2 | C-5080 | ||
| MgSO4 | M-5921 | ||
| 大型剪刀 | Fine Science Tools | 14070-12 | |
| 镊子 | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| 精细剪刀 | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| 昆虫针 | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Sylgard 184 (Dow-Corning) | |||
| 1L 容量瓶 | |||
| 100mL 容量瓶 |
参考文献
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- Myers, C. P. Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits. Neuron. 46, 37-49 (2005).
- Goulding, M., Pfaff, S. L. Development of circuits that generate simple rhythmic behaviors in vertebrates. Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 14-20 (2005).
- Gallarda, B. Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling. Science. 320, (2008).
- Gosgnach, S. V1 spinal neurons regulate the speed of vertebrate locomotor outputs. Nature. 440 (7081), 215-219 (2006).
- Lanuza, G. M., Gosgnach, S., Pierani, A., Jessell, T. M., Goulding, M. Genetic identification of spinal interneurons that coordinate left-right locomotor activity necessary for walking movements. Neuron. 42 (3), 375-386 (2004).
- Jiang, Z., Carlin, K. P., Brownstone, R. M. An in vitro functionally mature mouse spinal cord preparation for the study of spinal motor networks. Brain Res. 816 (2), 493-499 (1999).
- Ziskind-Conhaim, L., Gao, B. X., Hinckley, C. Ethanol dual modulatory actions on spontaneous postsynaptic currents in spinal motoneurons. J Neurophysiol. 89 (2), 806-813 (2003).
- Tabak, J., Rinzel, J., O'Donovan, M. J. The role of activity-dependent network depression in the expression and self-regulation of spontaneous activity in the developing spinal cord. J Neurosci. 21 (22), 8966-8978 (2001).
- Chub, N., Mentis, G. Z., O'Donovan, M. J. Chloride-sensitive MEQ fluorescence in chick embryo motoneurons following manipulations of chloride and during spontaneous network activity. J Neurophysiol. 95 (1), 323-330 (2006).
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