通过可逆生物素化测定质膜蛋白内吞速率

摘要

受调控的内吞作用决定了大多数膜蛋白在细胞表面的表达水平。本文中，我们利用可还原且不能透过膜的生物素化试剂，测定多拓扑膜蛋白——多巴胺转运体（DAT）的内吞速率。该方法为测定大多数质膜蛋白内吞速率提供了一种简便直接的途径。

摘要

质膜蛋白是一类庞大且多样的蛋白质，包括受体、离子通道、转运蛋白和泵。这些蛋白的活性介导多种关键的细胞事件，如营养物质的递送、细胞兴奋性以及化学信号传导。许多质膜蛋白通过内吞运输实现动态调控，这种调控通过改变蛋白在细胞表面的表达水平来调节其功能。介导蛋白内吞的机制十分复杂，目前对许多膜蛋白而言仍不完全清楚。为了全面理解调控特定蛋白内吞运输的机制，精确测定该蛋白的内吞速率至关重要。对于许多受体而言，通常可通过标记的受体配体直接测定其内吞速率。然而，对于转运蛋白、泵和离子通道等许多类型的膜蛋白，尚无便捷的配体可用于测定其内吞速率。在本报告中，我们描述了一种可逆生物素标记方法，用于测定多巴胺转运蛋白（DAT）的内吞速率。该方法为测量内化速率提供了一种简便的途径，并可广泛应用于大多数膜蛋白的运输研究。

方案

操作概述：

采用该方法，在运输受限条件（即低温）下，使用膜非通透性、二硫键偶联的生物素标记试剂（sulfo-NHS-SS-生物素），对细胞表面蛋白的可及胞外赖氨酸残基进行共价标记（示意图见图1）。一组细胞随后转移至允许运输的条件（37°C），使生物素标记的蛋白发生内化；另一组细胞则保持在低温下作为对照，用于：1）确定时间为零时的总表面蛋白量，以及2）脱标记对照。经过短暂的内化期后，细胞重新转移回低温环境以终止内化过程，并通过还原剂处理去除残留于细胞表面的生物素，该还原剂可裂解二硫键偶联的生物素。来源于细胞表面并已内化的生物素化蛋白则因受到保护而不被去除，成为唯一保留下来的生物素化蛋白。细胞裂解后，利用链霉亲和素亲和层析分离生物素化蛋白，并通过定量免疫印迹检测目标蛋白。为确定内吞速率，将内化蛋白的量与时间零点标记的总表面蛋白对照进行比较。我们已成功应用此方法测定神经元去甲肾上腺素¹和多巴胺^1-4转运体的内化速率。

详细实验步骤：

第1天：

1. 在6孔板中接种细胞，使其在第2天时汇合度约为80%。或者，若使用转染细胞，则应以适当密度进行转染，使其在测定内化速率时汇合度约为80%。若细胞贴壁不牢固，应使用细胞黏附基质（如聚-D-赖氨酸）处理组织培养器皿，以防止在多次洗涤步骤中发生细胞脱落。
2. 针对每种待检测的蛋白质，在一块培养板上包被两个孔，用于总表面蛋白（t=0）和剥离对照。在第二块培养板上，针对每种内化条件（即基础内吞速率与药物处理）各包被一个孔。
3. 配制以下溶液，并按指示温度保存，供第2天使用：
   • PBS²⁺磷酸盐缓冲液（pH 7.4），添加 1.5 mM MgCl₂，0.2 mM CaCl₂, (4°C)
   • 生物素化淬灭液PBS²⁺ 补充100 mM甘氨酸，（4°C)
   • NT缓冲液：150 mM NaCl，1.0 mM EDTA，0.2% BSA，20 mM Tris，pH 8.6，（4°C)
   • RIPA缓冲液：10 mM Tris，pH 7.4，150 mM NaCl，1.0 mM EDTA，0.1% SDS，1.0% Triton X-100，1.0% 脱氧胆酸钠，（4°C)
   • Sulfo-NHS-SS-生物素储存液：溶于二甲基亚砜（DMSO）至 200 mg/ml，-20°C)
   • 盐酸三(2-羧乙基)膦 (TCEP) 储备液： 500 mM in H₂O, (-20°C，用铝箔覆盖以避光

第2天：

1. 配制含0.18 g/ml葡萄糖和0.2% IgG/蛋白酶-free牛血清白蛋白的PBS²⁺溶液（PBS²⁺/g/BSA），并在水浴中预热至37°C。
2. 在实验台面上解冻sulfo-NHS-SS-生物素储备液，使其DMSO完全融化。使用前立即配制新鲜的sulfo-NHS-SS-生物素溶液（2.5 mg/ml，溶于冰浴预冷的PBS²⁺中，每孔需0.75 ml）。剧烈涡旋以充分溶解DMSO。注意：NHS-生物素试剂在水溶液中易发生水解，因此所有溶液均需现用现配。
3. 生物素标记：将培养板置于冷室中的冰浴上，用冰浴预冷的PBS²⁺溶液洗涤3次，每次2 ml。确保培养板略微倾斜，以便缓冲液完全排出。向每孔加入0.75 ml新鲜配制的sulfo-NHS-SS-生物素溶液，在冰浴中4°C剧烈振荡孵育15分钟。孵育结束后，重新配制新鲜的sulfo-NHS-SS-生物素溶液，替换原有溶液后再次在4°C冰浴中孵育15分钟。
4. 淬灭：必须彻底淬灭所有未反应的NHS-生物素分子，以防止细胞裂解后其与胞内蛋白发生非特异性生物素标记。用淬灭溶液洗涤细胞3次，每次2 ml，并在2 ml淬灭溶液中轻柔振荡孵育两次，每次15分钟，4°C。
5. 内化：若需测试药物处理效果，将适当浓度的药物加入PBS²⁺/g/BSA溶液中。将对照组培养板保持在4°C，将内化实验组培养板移出冷室。用预热的PBS²⁺/g/BSA溶液（含或不含药物）洗涤3次，每次2 ml，并将相同溶液（每孔2 ml）保留在孔中。向所有空孔中加入预热溶液，以确保培养板温度均匀。将细胞转移至37°C培养箱中孵育10分钟。在37°C孵育即将结束前，立即用NT缓冲液配制新鲜的50 mM TCEP溶液（用于后续剥离步骤），置于冰上保存，每孔需1.0 ml。
6. 剥离：立即将培养板转移至冰浴中并放回冷室。迅速用冰浴预冷的NT缓冲液洗涤细胞3次，每次2 ml，以终止内吞作用。同时用NT缓冲液洗涤剥离对照孔3次，每次2 ml。向每孔加入1.0 ml新鲜剥离溶液，在冰上4°C轻柔振荡孵育15分钟。更换为新鲜剥离溶液，继续在冰上4°C孵育15分钟。
7. 裂解：用NT缓冲液洗涤所有经剥离溶液处理的孔3次，每次2 ml。然后用PBS²⁺溶液洗涤所有孔（包括总蛋白对照孔）3次，每次2 ml。每孔加入300 μl RIPA裂解缓冲液（或其他适用于目标蛋白的裂解缓冲液），其中含有新鲜添加的蛋白酶抑制剂（1.0 mM PMSF，每种leupeptin、aprotinin和pepstatin各1.0 μg/ml）。在4°C振荡裂解20分钟。将裂解液转移至微量离心管中，在4°C以18,000 × g离心10分钟，清除细胞碎片。
8. 蛋白浓度测定：使用与裂解条件兼容的蛋白定量方法（例如DC蛋白测定法，Bio-Rad），根据标准BSA曲线测定各裂解液的蛋白浓度。
9. 链霉亲和素亲和层析：将各样品按等量蛋白分装至微量离心管中。加入裂解缓冲液，使各样品终体积为200 μl。剧烈涡旋使链霉亲和素琼脂糖珠充分混匀形成均匀悬液。使用剪去尖端的200 μl移液枪头，将珠子加入各管中，推荐用量为每50 μg裂解液使用20 μl珠子。在4°C旋转孵育过夜。

第3天：

1. 珠子洗涤：将样品在18,000 × g离心2分钟，以收集珠子。小心吸除裂解液，避免吸头接触珠子沉淀。可在吸头末端使用塑料移液吸头以更好地控制操作。向每管中加入0.75 ml裂解缓冲液，并涡旋振荡以洗涤珠子。再次于18,000 × g离心2分钟收集珠子，并重复吸除和洗涤步骤两次（共洗涤三次）。最后一次洗涤后，尽可能吸尽缓冲液，但不得扰动珠子沉淀。将离心管朝向吸头倾斜有助于此步骤的完成。
2. 样品洗脱：向每管中加入20–25 μl 2× Laemmli样品缓冲液（还原性）。还原剂将切断NHS-SS-生物素中的二硫键，使分离的蛋白质释放到溶液中。大多数膜蛋白在煮沸时极易发生聚集，因此在进行SDS-PAGE上样前不应加热。在开展这些实验之前，应先确定目标蛋白对热的耐受性。若目标蛋白不能耐受煮沸或加热，则在进行SDS-PAGE分析前，于室温下在旋转摇床上孵育30分钟。此条件足以切断二硫键并实现蛋白质的洗脱。
3. SDS-PAGE与免疫印迹：通过SDS-PAGE分离蛋白质。对于每个样品，建议按以下顺序上样：总表面蛋白（时间=0）、剥离后、内化条件#1、条件#2等。电转移至膜后，使用针对目标蛋白的特异性抗体进行免疫印迹。采用CCD相机凝胶成像系统采集免疫反应条带，确保无像素饱和现象。使用凝胶分析/密度测定软件对各条带密度进行定量。

代表性结果：

图2A显示了一个典型的免疫印迹结果。“总”泳道（T）信号最强，代表内化前细胞表面蛋白的总量。“剥离”对照泳道（S）理想情况下应接近空白，表明剥离步骤在实验中是有效的。剥离效率通过比较“剥离”泳道与“总”泳道的条带密度来计算（例如，该蛋白与剥离组同时进行了生物素标记，但既未在37°C孵育，也未接触剥离溶液）。计算公式如下：

[1-(剥离/总)]*100%

使用该公式计算，图2中的条带效率为99.8%。最后，您将在内化泳道（I）中观察到强度低于总蛋白条带的较弱条带。在该示例（图2）中，细胞分别用溶剂或1 μM佛波酯肉豆蔻酸乙酸酯（PMA）处理，进行10分钟的内化过程，并测量多巴胺转运体在初始10分钟内化阶段的内化速率。内化速率的计算公式如下：

内化量/总量×100

如图2B所示，在给予溶剂处理的条件下，10.4%的细胞表面DAT在10分钟内发生内化。PMA处理使DAT内化速率增加至总细胞表面DAT的23.2%。

图1. 实验方案示意图。 细胞在4°C下进行生物素标记，以特异性地标记细胞表面蛋白群体，随后转移至37°C以启动内吞作用。内吞完成后，细胞迅速冷却以终止内吞过程，并通过还原剂处理去除残留的细胞表面生物素。唯一保留下来的生物素化蛋白是那些在t=0时刻位于细胞表面并已被内吞的蛋白，因此它们免于被还原剂去除。通过链霉亲和素磁珠进行批量亲和层析分离生物素化蛋白，目标蛋白则通过免疫印迹检测。

图2. PKC激活增加DAT的内吞速率。 内化实验。稳定表达DAT的PC12细胞经生物素标记后，在4°C下进行处理，具体步骤见“详细方案”。将细胞迅速升温至37°C，并在±1 μM PMA条件下孵育10分钟（37°C）。通过还原法去除残留的生物素，收集细胞并裂解，利用链霉亲和素亲和层析分离生物素化蛋白。（A）代表性免疫印迹图显示在指定条件下t=0时的总表面DAT（T）、漂洗对照（S）以及内化DAT（I）。（B）使用CCD相机采集条带信号，并通过Quantity One软件（Bio-Rad）进行定量分析。数据以每10分钟内化DAT占总DAT的百分比表示。

图3. 显示生物素剥离效果不佳的免疫印迹示例。 内化实验。稳定表达多巴胺转运体（DAT）的PC12细胞在4°C下进行生物素标记，操作步骤详见“详细方案”。细胞迅速升温至37°C，并在37°C孵育10分钟。通过还原法去除残留生物素后，裂解细胞，并利用链霉亲和素亲和层析分离生物素化蛋白。免疫印迹结果显示t=0时总的表面DAT（T）、剥离对照（S）以及内化DAT（I）。注意剥离对照泳道中可见条带，表明剥离效率较低。

讨论

常见问题：这些实验中最常见的问题是 stripping 效率低下。stripping 效率对于结果的解读至关重要。除非 stripping 效率非常高，否则无法得出内化泳道中任何生物素标记的蛋白质确实是从细胞表面内化的结论。stripping 效率 ≥90% 为最佳，若效率低于此水平，我们将舍弃所有结果。图 3 展示了一个低效 stripping 的示例。请注意，stripping 泳道中的条带非常明显，对应的 stripping 效率为 34%。如果出现 stripping 效率低下的情况，可能是在添加到细胞前未 freshly 配制 TCEP 溶液；或者 TCEP 已降解，需要购买新的试剂。使用 TCEP 粉末而非溶液形式，可能有助于避免此问题。

可能的修改： 在本报告中，我们测量了多巴胺转运体（DAT）内化在最初10分钟内的相对速率，并将其与蛋白激酶C（PKC）激活期间的DAT内化速率进行了比较。另一种方法是通过将细胞在不同时间点进行温育，以测定绝对内化速率。尽管这种方法可能实现，但根据我们的经验，早期时间点的信号水平较低，加之实验间的变异性，导...