本视频演示了如何在 PuraMatrix（一种市售的自组装肽凝胶）中包封和培养癌细胞。
本文内容
摘要
摘要
越来越多的证据表明，将癌细胞在三维条件下进行培养，能够更准确地模拟肿瘤生物学的复杂性。许多此类模型使用来源于动物的重建基底膜，其中含有可影响这些细胞培养模型生长的可变含量的生长因子和细胞因子。在此，我们详细描述一种 commercially available（商品化）自组装肽凝胶 PuraMatrix 的制备与使用方法。该材料不含动物源性成分和病原体，可用于包裹并培养卵巢癌细胞系 OVCAR-5。我们首先介绍如何在使用前对 PuraMatrix 进行准备。随后，我们演示如何正确混合 PuraMatrix 与细胞悬液，以将细胞包埋于水凝胶中。当加入细胞培养基或将其注入生理环境后，PuraMatrix 中的肽组分会迅速自组装形成一种三维水凝胶，该凝胶具有纳米级纤维结构，平均孔径为 5–200 nm。1此外，我们展示了如何扩增在封装的 PuraMatrix 中培养的细胞。当 OVCAR-5 细胞被封装在 PuraMatrix 中时，会自组装成三维腺泡样结构，其形态比传统的单层体外模型更接近临床中观察到的微转移结节。通过共聚焦显微镜，我们展示了接种后第 1、3、5 和 7 天，封装于 PuraMatrix 中的代表性 OVCAR-5 细胞的形态变化。使用 PuraMatrix 培养癌细胞将有助于加深我们对该疾病的理解，并使我们能够在更具临床预测价值的模型系统中评估治疗反应。
方案
技术说明：
- 凝胶化反应由盐的添加引发。因此，在尚未需要凝胶化时，盐类物质绝不可与 PuraMatrix 接触；暴露于离子强度极低的盐溶液（例如 < 0.05 M）将导致不可逆的凝胶化。
- 配制后剩余的储存液，只要未接触盐类，可在日后继续使用。无需担心重复进行超声处理。
- 可通过将 PuraMatrix 分装至无菌离心管中并离心，以去除气泡。
- 更换培养基时需格外小心，吸液操作可能轻易破坏 PuraMatrix 层。
材料：
BD PuraMatrix RAD16 肽水凝胶-1%（货号 # 354250）：未稀释混合物的总肽浓度为 10 mg/mL。
- 水浴超声波破碎仪或涡旋振荡器
- 96孔细胞培养板
- 细胞培养基
- 无菌过滤的 H2O
- 无菌过滤的 20% 蔗糖溶液
- 细胞（每孔 5,000 个细胞）：OVCAR-5
所有步骤都必须在无菌条件下进行。
实验步骤：
- 使用水浴超声仪对1% PuraMatrix（RAD16）进行30分钟超声处理，以降低其黏度，便于后续使用。
- 现在可将1% PuraMatrix溶液分装至无菌离心管中，以便简化后续实验。
- 避免产生气泡；若出现气泡，只需将含有PuraMatrix的无菌管在1000 rpm（300 × g）下离心5分钟即可。
- 未稀释混合物的总肽浓度为10 mg/ml。
- 分别在两组4个孔中接种，使总肽浓度分别为2.5 mg/ml和1.25 mg/ml。
- 用0.2 μm滤膜过滤的20%蔗糖和13.3%蔗糖分别稀释每组孔中的PuraMatrix，使总肽浓度达到5 mg/ml和2.5 mg/ml，从而获得在10%蔗糖中浓度为2×的BD PuraMatrix。
- 配制20%蔗糖：溶解10 g蔗糖，加水定容至50 ml。
- 13%和10%蔗糖可通过稀释20%储备液制备。
- 13%蔗糖（每10 ml）：6.5 ml 20%蔗糖 + 3.5 ml无菌H2O。
- 10%蔗糖（每10 ml）：5.0 ml 20%蔗糖 + 5.0 ml无菌H2O。
- 根据拟接种的孔数，配制PuraMatrix肽的母液混合物。（见下文示例。）然后将母液分装至各单独离心管中，每管含25 ml母液。
- 母液应配制成目标最终总肽浓度的两倍，因为在接种时将与等体积的细胞悬液混合而被稀释。
- 母液应配制成目标最终总肽浓度的两倍，因为在接种时将与等体积的细胞悬液混合而被稀释。
- 通过胰蛋白酶消化单层细胞培养物来制备细胞悬液。
- 每个T-75培养瓶可使用2 ml 0.05%胰蛋白酶-EDTA。
- 加入含10%热灭活胎牛血清的细胞培养基以中和胰蛋白酶（每使用1 ml胰蛋白酶，至少加入2 ml培养基）。
- 在1000 rpm（约300 × g）下离心5分钟，形成细胞沉淀。
- 用10%无菌过滤蔗糖重悬细胞。
- 计数细胞后，再次在1000 rpm（约300 × g）下离心5分钟，以去除培养基中残留的微量盐分。
- 将OVCAR-5细胞以2.0 × 105 个细胞/ml的密度重悬于10%蔗糖中，使每孔最终细胞数为5,000个细胞。
以下步骤应迅速操作。 - 如上图所示，向第一个含有25 μl PuraMatrix母液的单独离心管中加入25 μl浓度为2.0 × 105 个细胞/ml的细胞悬液。
- 通过移液器轻轻吹打约5次（上下吹打），迅速混匀，注意不要引入气泡。
- 然后将50 μl细胞悬液/PuraMatrix混合物移入96孔板的相应孔中。
- 通过移液器沿孔壁轻轻加入150 μl细胞培养基（RPMI + 10% FBS），启动BD PuraMatrix的凝胶化过程
- 重复第8步的操作，直至所有孔均完成接种。
- 30分钟后，极其轻柔地使用200 μl移液器移除约2/3的培养基，以平衡水凝胶的pH值。
- 切勿使用真空抽吸器，否则会破坏基质结构
- 将移液器吸头放入孔中，确保不接触PuraMatrix凝胶层，轻柔地吸出培养基。
- 在PuraMatrix中培养细胞时，应特别注意避免扰动基质。
- 极其轻柔地沿含有包裹在PuraMatrix中细胞的孔壁加入150 μl新鲜细胞培养基。
- 每隔48小时，通过仔细重复步骤10和11，更换每孔中的细胞培养基。
代表性结果：
图1. OVCAR-5 细胞按照上述方案进行包封。图像使用配备 Spectra-Physics DeepSee 钛宝石激光器（调谐至750 nm）的倒置 Olympus FV1000 显微镜采集。成像分别在接种后第1、3、5和7天进行。采用长工作距离水浸式40倍物镜（Olympus LUMPLFLN 0.8 NA）对PuraMatrix内部进行成像。通过以1.47 μm轴向步长采集图像堆栈，获得三维图像体积。两个非扫描探测器分别使用紫光（440-490 nm）和绿光（510-550 nm）带通滤光片收集自发荧光信号。最终图像及深度堆栈视频通过ImageJ软件合并两个探测通道的数据进行处理。请点击此处查看图1的放大版本。
参考文献
- Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. Designer self-assembling Peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures. PLoS One. 1, e119-e119 (2006).
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