KLRG1 四聚体的制备方案

摘要

本方案描述了KLRG1四聚体的制备方法，这是一种用于分析KLRG1配体的有力工具。

摘要

杀伤细胞凝集素样受体G1（KLRG1）是一种属于C型凝集素样超家族的II型跨膜糖蛋白抑制性受体。KLRG1以单体和二硫键连接的同源二聚体两种形式存在。这种高度保守的受体表达于最成熟且近期被激活的自然杀伤细胞上，同时也表达于一部分效应/记忆T细胞亚群中。

利用KLRG1四聚体及其他方法，已鉴定E-、N-和R-钙黏蛋白为KLRG1的配体。这些依赖Ca²⁺的细胞间黏附分子包含一个胞外结构域，该结构域含有五个介导细胞间相互作用的钙黏蛋白重复序列，以及一个跨膜结构域和一个与肌动蛋白细胞骨架相连的胞质结构域。

KLRG1四聚体的制备对于鉴定KLRG1配体至关重要。KLRG1四聚体也是一种独特的工具，可用于阐明钙黏蛋白与KLRG1在调控免疫应答及组织完整性中所发挥的作用。

方案

包涵体的制备

1. 将表达KLRG1质粒构建体的细菌过夜培养物接种至4个500 ml的TB培养基中，每个培养基含有50 μg/ml羧苄青霉素和氯霉素。当600 nm处的OD值达到0.6 Å时，加入0.4 M IPTG进行诱导，并在37°C下继续振荡培养4小时。
2. 用重悬缓冲液（pH=8.0，含50 mM Tris-HCl、25% (W/V) 蔗糖、1 mM EDTA、10 mM DTT）重悬收集的菌体。注意：此步骤的菌体沉淀可在此阶段冷冻保存。
3. 将不超过60 ml的菌体重悬液汇集至一个聚丙烯烧杯中。如有必要，用pH 8.0的TE缓冲液调整体积至60 ml，并以半速搅拌混合物。
4. 在搅拌过程中逐滴加入以下成分：溶菌酶（终浓度=1 mg/ml）、MgCl₂（终浓度=5 mM）、含75 mM NaCl的50%甘油中的2 mg DNA酶I、Triton-X100（终浓度=1%）、DTT（终浓度=10 mM）。
5. 将溶液在冰上超声处理1.5分钟，然后在4°C下以5,000 RPM离心10分钟。
   1. 倾去上清液。
   2. 加入15 ml洗涤缓冲液（pH=8.0，含50 mM Tris-HCl、0.5% Triton X-100、100 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM DTT）。
   3. 在冰上将溶液超声处理1.5分钟，直至沉淀完全重悬。
   4. 在4°C下以5,000 RPM离心10分钟。
   5. 重复洗涤5次。
6. 使用不含Triton X-100的洗涤缓冲液重复步骤5b，离心后重悬于4 ml TE缓冲液中。
7. 称取湿重的包涵体悬液，并以30至100 mg/ml的浓度保存在TE缓冲液中。

KLRG1 的复性

1. 配制1 L pH=8.0的复性缓冲液（0.4 M Arginine-HCl、0.1 M Tris pH 8–8.3、2 mM EDTA、0.2 mM PMSF、3片不含EDTA的蛋白酶抑制剂片剂、5 mM GSH和0.5 mM GSSG），在搅拌的同时冷却至4°C。
2. 准备用于注入复性混合液的包涵体：理想情况下进行5–10次注入，每次注入浓度为0.25–0.5 μM，使蛋白最终浓度达到2–3 μM。
   1. 将含50 mg包涵体的浆液溶于7 M GnHCl并加入10 mM β-巯基乙醇中，使其完全溶解。
   2. 将包涵体/GnHCl混合物在37°C下保温30–40分钟，每5分钟涡旋振荡一次，以确保完全溶解（完全溶解后浆液将变得澄清）。
   3. 在4°C下以最大转速离心30分钟，将上清液转移至15 ml离心管中。注意不要转移任何少量黑色沉淀。
3. 用注射缓冲液（3 M GnHCl、10 mM NaAcetate、pH 4.2、10 mM EDTA）调节体积。
4. 每小时注入1 ml稀释后的包涵体溶液。注入时高速搅拌，逐滴加入1 ml稀释包涵体，每滴间隔2秒。注射完成后改为低速搅拌。
5. 在4°C下继续低速搅拌过夜。

复性反应的浓缩

1. 按照 Millipore 的方案，使用 Amicon 搅拌式超滤池和 YM10 NMWL 10K 超滤膜（Millipore），将 1 L 预过滤（0.22 μm 滤膜过滤）的复性反应液浓缩至约 10 ml。
2. 使用 Centriplus YM-10 10K MWCO（Millipore）进一步浓缩至 ≤2 ml。

KLRG1四聚体的纯化

1. 根据 GE Healthcare 的操作手册，在 4°C 下设置 AKTAFPLC 系统。
2. 使用 Sephacryl S-200 16/60 高分辨率柱（GE Healthcare），在 20 mM HEPES 和 150 mM NaCl 缓冲液中通过尺寸排阻色谱法纯化 KLRG1 的单体形式。（见图 1）。
3. 使用 Centriplus YM-10 10K MWCO（Millipore）将样品浓缩至 1 ml。
4. 按照 Avidity 公司的实验方案，使用 BirA 酶对 KLRG1 单体进行生物素标记。
5. 通过与步骤 2 相同的尺寸排阻色谱法去除游离生物素。
6. 通过将 KLRG1 单体与 4 倍摩尔过量的 PE 标记链霉亲和素（BD Biosciences）混合，使 KLRG1 分子形成四聚体。

代表性结果

图1. 重折叠KLRG1蛋白经AKTA FPLC凝胶过滤层析获得的典型阳性结果。该图显示了重折叠KLRG1的单体（83.52 ml）、二聚体（56.36 ml）和多聚体（36.26 ml）形式的分离情况。94.25 ml处的峰代表缓冲液置换组分。

讨论

本方案展示了如何纯化、生物素标记并四聚化KLRG1。KLRG1四聚体可用于通过流式细胞术标记KLRG1配体。尽管每种蛋白质的复性条件需通过实验经验确定，但其他C型凝集素可采用类似方案进行四聚化。利用四聚化的蛋白质作为探针，有望鉴定孤儿C型凝集素受体的配体。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BirA 酶和缓冲液	生物素化试剂盒	Avidity	BIRA500
Complete Mini 蛋白酶抑制剂片剂，无 EDTA	试剂	Roche 集团	11 836 170 001	或同等产品
Amicon 搅拌式超滤池	设备	EMD Millipore	型号 #8400	或同等产品
YM10 NMWL 10K 超滤膜	过滤耗材	EMD Millipore	13642
15 ml YM10 浓缩管	过滤耗材	EMD Millipore	4411
AKTAFPLC	设备	GE Healthcare	18-1900-26
Sephacryl S-200 16/60 高分辨率柱	设备	GE Healthcare	17-1166-01
链霉亲和素 PE	试剂	BD Biosciences	554061	或同等产品