未脱钙骨组织学为多种临床和科研应用提供了重要信息。该技术操作上具有挑战性，尤其是对于大尺寸标本。本视频展示了制备高质量切片的过程，并演示了其中的技术难点及克服这些困难的方法。
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摘要
摘要
未脱钙骨组织学可展示骨的微细结构，同时显示骨的矿化成分和细胞成分，从而提供有关骨转换、骨形成与骨吸收的重要信息。该技术在多种临床和科研应用中具有重要意义，能够获得精美的图像1，并可进行荧光标记分析和骨组织形态计量学等技术2。荧光标记分析是一种在特定时间点注射可与钙结合的荧光染料的技术，从而实现对该时间点矿化程度的定量分析。骨组织形态计量学则是在显微水平上对骨进行定量分析的方法。
进行未脱钙骨组织学研究在技术上具有挑战性，尤其是对于大尺寸标本而言。该技术与常规石蜡包埋组织学方法存在差异。本视频展示了如何制备高质量切片，并演示了其中的技术难点及克服这些困难的方法。标本的制备、固定和处理方式与其他软组织类似，但由于骨组织密度高、通透性低，所需的固定和处理时间显著延长，通常需要数周时间。包埋需使用硬度和密度与骨组织相似或相等的支撑介质，例如甲基丙烯酸甲酯类树脂；但与石蜡浸润和包埋不同，此步骤不可逆。切片可通过研磨方式完成，所得切片较厚，适用于荧光染料分析等研究，最好使用大组织切片机上的金刚石刀具进行。或者，也可使用滑动式切片机配合极锋利的刀片制备更薄的切片，用于光学显微镜观察。滑动式切片机能为大而坚硬的组织块提供所需的额外强度和稳定性。树脂包埋切片可用多种染色剂染色，本视频对此进行了演示。
方案
- 将组织置于含有10%磷酸盐缓冲甲醛溶液的密封容器中3确保尽量减少光照暴露，如果要进行荧光染料分析，因为荧光染料对光敏感。
- 确定组织所需的方向。
- 使用带锯按照正确的方向将标本修剪至所需尺寸，注意遵守安全操作规范。随后将标本放入不透明容器中，容器体积应约为标本体积的十倍，以确保充分固定。标本在福尔马林溶液中固定时间应为一至两周，具体时长根据标本大小而定。建议使用对照组织进行测试和优化。
- 检查组织是否能放入包埋模具中，然后将组织置于装有70%乙醇的密封不透明容器内。
- 将组织置于梯度浓度的乙醇中进行处理，避光并持续振荡。
- 70 % 乙醇 1 周
- 80 % 乙醇 1 周
- 90% 乙醇，1 周
- 100% 乙醇 1 周
- 组织随后在正丁醇中透明处理1周，期间需避光并持续振荡。
- 树脂与骨的密度应尽可能接近。 树脂的密度可以调整（见步骤8），我们建议先包埋一个测试样本以确保密度合适。我们使用Technovit 7100（Heraeus Kulzer）进行光学显微镜观察和荧光染料分析。如果需要进行免疫组织化学染色，则必须使用其他树脂，例如Technovit 9100（Heraeus Kul....
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致谢
作者谨此感谢 Sue Connell 女士在树脂包埋方面的专业协助，以及 Stephania Tombs 女士在实验室技术方面的专业支持。作者谨向 Frank Kandziora 教授和 Marie-Anne Polboth 博士致以诚挚谢意，感谢他们提供的宝贵建议。
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参考文献
- Kerr, J. Atlas of Functional Histology. , Harcourt Publishing. Melbourne, Australia. 164-168 (2000).
- Parfitt, A. M. Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. J Bone Miner R....
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