未脱钙骨组织制备用于组织学、组织形态计量学及荧光标记分析

摘要

未脱钙骨组织学为多种临床和科研应用提供了重要信息。该技术操作上具有挑战性，尤其是对于大尺寸标本。本视频展示了制备高质量切片的过程，并演示了其中的技术难点及克服这些困难的方法。

摘要

未脱钙骨组织学可展示骨的微细结构，同时显示骨的矿化成分和细胞成分，从而提供有关骨转换、骨形成与骨吸收的重要信息。该技术在多种临床和科研应用中具有重要意义，能够获得精美的图像¹，并可进行荧光标记分析和骨组织形态计量学等技术²。荧光标记分析是一种在特定时间点注射可与钙结合的荧光染料的技术，从而实现对该时间点矿化程度的定量分析。骨组织形态计量学则是在显微水平上对骨进行定量分析的方法。

进行未脱钙骨组织学研究在技术上具有挑战性，尤其是对于大尺寸标本而言。该技术与常规石蜡包埋组织学方法存在差异。本视频展示了如何制备高质量切片，并演示了其中的技术难点及克服这些困难的方法。标本的制备、固定和处理方式与其他软组织类似，但由于骨组织密度高、通透性低，所需的固定和处理时间显著延长，通常需要数周时间。包埋需使用硬度和密度与骨组织相似或相等的支撑介质，例如甲基丙烯酸甲酯类树脂；但与石蜡浸润和包埋不同，此步骤不可逆。切片可通过研磨方式完成，所得切片较厚，适用于荧光染料分析等研究，最好使用大组织切片机上的金刚石刀具进行。或者，也可使用滑动式切片机配合极锋利的刀片制备更薄的切片，用于光学显微镜观察。滑动式切片机能为大而坚硬的组织块提供所需的额外强度和稳定性。树脂包埋切片可用多种染色剂染色，本视频对此进行了演示。

方案

1. 将组织置于含有10%磷酸盐缓冲甲醛溶液的密封容器中³确保尽量减少光照暴露，如果要进行荧光染料分析，因为荧光染料对光敏感。
2. 确定组织所需的方向。
3. 使用带锯按照正确的方向将标本修剪至所需尺寸，注意遵守安全操作规范。随后将标本放入不透明容器中，容器体积应约为标本体积的十倍，以确保充分固定。标本在福尔马林溶液中固定时间应为一至两周，具体时长根据标本大小而定。建议使用对照组织进行测试和优化。
4. 检查组织是否能放入包埋模具中，然后将组织置于装有70%乙醇的密封不透明容器内。
5. 将组织置于梯度浓度的乙醇中进行处理，避光并持续振荡。
   1. 70 % 乙醇 1 周
   2. 80 % 乙醇 1 周
   3. 90% 乙醇，1 周
   4. 100% 乙醇 1 周
6. 组织随后在正丁醇中透明处理1周，期间需避光并持续振荡。
7. 树脂与骨的密度应尽可能接近。 树脂的密度可以调整（见步骤8），我们建议先包埋一个测试样本以确保密度合适。我们使用Technovit 7100（Heraeus Kulzer）进行光学显微镜观察和荧光染料分析。如果需要进行免疫组织化学染色，则必须使用其他树脂，例如Technovit 9100（Heraeus Kulzer）。
8. Technovit 7100 制备液可根据需要与试剂盒中提供的软化液少量混合，但软化液的体积不得超过制备液总体积的5%；根据我们的经验，通常很少需要使用软化液。将等体积的无水乙醇与Technovit 7100基础液混合，作为预浸液用于组织处理，避光并持续振荡处理24小时。
9. 然后使用1克硬化剂I（=1袋）溶于100毫升基础液中配制浸润溶液。该溶液替换预浸溶液，并在持续振荡条件下浸润1周。
10. 将组织放入模具中，切面朝下。组织周围应留出一定边缘（理想情况下至少5毫米）以容纳树脂，从而确保包埋块的强度。取15 ml Technovit 7100 配制液与1 ml 固化剂II混合，倒入模具中环绕标本，并完全覆盖标本，覆盖厚度至少5毫米。固化将在2小时内开始，但需过夜方可完全完成。
11. 然后使用Technovit 3040（Heraeus Kulzer）制备背衬块进行包埋。按2份粉末与1份液体的体积比混合Technovit 3040，得到黏稠液体。将Technovit 3040倒入模块背面的凹槽中，液面至少高出模块底部2 mm。约10分钟后，可剥离模具，包埋块即制备完成。
12. 甲基丙烯酸甲酯树脂的密度及其相应的切片性能受室内环境湿度的影响。因此，树脂包埋块应保存在干燥器中。
13. 磨切法可产生厚度在20–50微米之间的较大切片。该方法适用于荧光染料分析（见下文），因为较厚的切片可产生更强的荧光信号。将金刚石刀片固定至切片机上，并向切片机的储液槽中加入润滑剂（如石油醚）。将组织块固定于夹具中，并调整其相对于刀片的方向。缓慢进行研磨（每张切片约需20–30分钟），确保充分润滑。第一张切片用于暴露切割面并确定切片方向，应予以弃去。
14. 接下来将切片置于Superfrost Plus载玻片上。由于切片容易卷曲，建议在其上覆盖一小块三明治袋，再用另一张载玻片压紧固定，以保持平整。随后将其放入60–80摄氏度的孵育箱中孵育1小时。此步骤可软化甲基丙烯酸酯，有助于切片平整地贴附于载玻片上。
15. 可根据需要使用细粒砂纸以轻柔的方式对切面进行清洁和抛光。
16. 滑动式切片机可切出用于光学显微镜观察的最佳薄切片。应使用滑动式切片机，因其具有额外的刚性，适合切割此类较硬的包埋块。也可选用电动旋转切片机。使用锋利的不锈钢刀片，建议准备两把刀片，以便在使用其中一把时可对另一把进行磨利。刀片与包埋块之间应呈45度角。如需要，可通过在包埋块表面贴附湿滤纸实现软化处理。可能需要连续切片多次，才能达到理想的切片状态以获得高质量切片。随后将切片漂浮于水浴中，并按上述第16步操作转移至载玻片上。
17. 染色试剂列于下方材料部分。方案基于Bancroft⁴ 等人。由于组织厚度存在差异，建议先在测试切片上优化染色条件。使用染色架可能导致组织从载玻片上脱落，因此可能需要直接将染色液加至平放的载玻片上。为获得组织形态计量学所需的稳定染色结果，必须采用完全相同的染色方案或使用染色架进行染色。
    1. 苏木精和伊红
       1. 苏木精染色5-10分钟
       2. 用Scott的自来水充分清洗
       3. 用伊红染色5分钟
       4. 用自来水冲洗
       5. 二甲苯透明
       6. 安装
       7. 结果
          1. 类骨质 = 粉红色
          2. 钙化骨 = 紫褐色
          3. 细胞核 = 蓝色
    2. Von Kossa
       1. 置于硝酸银溶液中，并暴露于强光下，直至矿化骨变黑（约10分钟）
       2. 用蒸馏水洗涤三次
       3. 用硫代硫酸钠处理 5 分钟
       4. 用蒸馏水清洗
       5. 用藏红O复染
       6. 二甲苯透明
       7. 安装
       8. 结果
          1. 矿化骨 = 黑色
          2. 类骨质 = 红色/粉红色
    3. 马松-戈德纳三色染色法
       1. 用碱性酒精洗涤（80%乙醇90毫升与25%氨水10毫升混合，作用20分钟）
       2. 用水冲洗
       3. 用蒸馏水冲洗
       4. 用Weigert苏木精染色10分钟
       5. 用蒸馏水冲洗
       6. 用Ponceau-Fuchsin终染液染色5分钟
       7. 用1%乙酸冲洗15秒
       8. 在磷钼酸-橙G溶液中染色5分钟
       9. 用1%乙酸冲洗15秒
       10. 用亮绿色染色5分钟
       11. 用1%乙酸冲洗，换液3次
       12. 用蒸馏水冲洗
       13. 安装
       14. 结果
           1. 矿化骨 = 绿色
           2. 类骨质 = 红色/橙色
           3. 细胞核 = 蓝灰色
           4. 软骨 = 紫色
18. 荧光染料制备：
19. 通过缓慢静脉注射给药，间隔至少两周。
20. 剂量
    1. 钙黄绿素绿 10 mg/kg 静脉注射
    2. 土霉素 50 mg/kg 静脉注射
    3. 茜素络合酮 30 mg/kg 静脉注射
21. 荧光素绿的制备
    1. 1 克荧光素绿用 1 M NaOH 滴定至溶解。
    2. 用1% NaOH调节pH至7.1–7.2。
    3. 过滤并避光保存
22. 茜素络合酮的制备
    1. 将3克茜素复合酮用1 M NaOH滴定至溶解。
    2. 然后用1% HCl或NaOH调节pH至7.1–7.2。
    3. 过滤并避光保存
23. 土霉素的制备
    1. 土霉素是一种现成的抗菌药物，无需配制。