从夏威夷短尾乌贼 Euprymna scolopes 中获取血细胞并观察其对共生与非共生细菌的黏附性

摘要

本视频将演示如何从夏威夷短尾乌贼（Euprymna scolopes）中获取血细胞（血淋巴细胞），用于细胞生物学和细菌黏附实验。血细胞将用荧光染料染色，并与表达GFP的标记细菌共孵育。

摘要

近年来，关于免疫系统在有益细菌与其宿主之间介导分子信号传导作用的研究，极大地增进了我们对真核生物与其微生物群共同进化的理解。夏威夷短尾鱿鱼与其共生的费氏弧菌之间的共生关系，Euprymna scolopes以及发光细菌Vibrio fischeri已被用作研究有益细菌对动物发育影响的模式系统。最近的研究表明，类似巨噬细胞的血细胞——该鱿鱼宿主先天免疫系统的唯一细胞组分——可能在介导这一共生关系的建立与维持过程中发挥重要作用。本实验方案将演示如何从鱿鱼中获取血细胞E. scolopes然后将这些细胞用于细菌结合实验。首先将成年鱿鱼麻醉，再用注射器从其头部主要的血管中采集血淋巴。从血淋巴中提取的宿主血细胞被接种到带孔的玻璃盖玻片上，随后暴露于绿色荧光蛋白标记的共生菌。Vibrio fischeri以及非共生的Vibrio harveyi. 使用荧光染料（Cell Tracker Orange，Invitrogen）对血细胞进行复染，然后通过荧光显微镜观察。

方案

1. 制备 500 mL 的 0.22 μm 经滤膜除菌的人工海水（FSW；盐度 35 ppt）。将人工或天然海水通过滤膜过滤 0.22 μm 微米滤膜过滤以去除颗粒和细菌。
2. 麻醉一只成年夏威夷短尾鱿鱼（Euprymna scolopes）Euprymna scolopes将动物置于含2%乙醇的FSW溶液中进行麻醉。麻醉时间约为10分钟。乌贼将停止游动，且对触碰无主动反应。此时仍应观察到由外套膜运动指示的持续呼吸作用以及色素细胞的活动。
3. 将鱿鱼腹面朝上置于标准石蜡解剖盘中，用含2%乙醇的过滤海水（FSW）淹没动物。
4. 使用一种标准 200 μl 移液管吸头，向后拉开漏斗和外套膜，以暴露位于两眼之间的主头静脉血管。
5. 使用无菌的1 mL注射器（配26.5号针头），穿刺头静脉血管，抽取50–100 μl 血淋巴。将血淋巴置于冰上的一次性无菌1.5 mL离心管中。
   注意：如果一只动物将多次作为供体，每次仅采集10-20 μl 任何时间点的血淋巴量。将动物放回正常海水水箱中，动物将在30分钟内恢复。
6. 新鲜采集的血细胞经洗涤后重悬于 500 μl 的鱿鱼林格溶液（S-Ringers；530 mM NaCl，10 mM KCl，25 mM MgCl₂，10 mM CaCl₂ 和 10 mM HEPES 缓冲液（pH 7.5）。
7. 通过血细胞....

讨论

近年来，关于免疫系统在有益细菌与其宿主之间介导分子信号传导作用的研究，极大地增进了我们对真核生物与其微生物群共同进化的理解。鱿鱼/弧菌系统已被证明是回答该领域基本问题的一个可行模型系统^2,3,5,6,8。鱿鱼Euprymna scolopes的发光器官仅允许发光细菌Vibrio fischeri定植。由于容纳细菌的组织始终与海水接触，鱿鱼宿主不仅必须促进这种特异性共生关系，还必须持续排斥其他细菌。持续的研究表明，类似巨噬细胞的血细胞可能在该共生关系的建立和维持过程中发挥重要作用^1,4,7。由于鱿鱼宿主缺乏适应性免疫系统，这种共生关系中所表现出的高度特异性必然完全或部分由先天免疫系统介导。最近对这些血细胞的一项研究表明，从E. scolopes中分离出的血细胞能够差异性地识别并吞噬V. fischeri和非共生细菌，且定植过程可能诱导了对共生菌的一种“免疫耐受”⁴。本实验方案将演示如何成功地从成年鱿鱼中获取这些血细胞，并检测其结合细菌的能力。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Lab-Tek 8孔腔室#1.0硼硅酸盐盖玻片系统	Thermo Fisher Scientific, Inc.	155411
26.5 G 1ml 无乳胶胰岛素注射器	BD Biosciences	C34551
Cell Tracker Orange	Invitrogen	C34551
SteREO Discovery V20 显微镜	Carl Zeiss, Inc.
SP2 共聚焦显微镜	Leica Microsystems