本视频将演示如何从夏威夷短尾乌贼（Euprymna scolopes）中获取血细胞（血淋巴细胞），用于细胞生物学和细菌黏附实验。血细胞将用荧光染料染色，并与表达GFP的标记细菌共孵育。
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本文内容
摘要
摘要
近年来，关于免疫系统在有益细菌与其宿主之间介导分子信号传导作用的研究，极大地增进了我们对真核生物与其微生物群共同进化的理解。夏威夷短尾鱿鱼与其共生的费氏弧菌之间的共生关系，Euprymna scolopes以及发光细菌Vibrio fischeri已被用作研究有益细菌对动物发育影响的模式系统。最近的研究表明，类似巨噬细胞的血细胞——该鱿鱼宿主先天免疫系统的唯一细胞组分——可能在介导这一共生关系的建立与维持过程中发挥重要作用。本实验方案将演示如何从鱿鱼中获取血细胞E. scolopes然后将这些细胞用于细菌结合实验。首先将成年鱿鱼麻醉，再用注射器从其头部主要的血管中采集血淋巴。从血淋巴中提取的宿主血细胞被接种到带孔的玻璃盖玻片上，随后暴露于绿色荧光蛋白标记的共生菌。Vibrio fischeri以及非共生的Vibrio harveyi. 使用荧光染料（Cell Tracker Orange，Invitrogen）对血细胞进行复染，然后通过荧光显微镜观察。
方案
- 制备 500 mL 的 0.22 μm 经滤膜除菌的人工海水（FSW；盐度 35 ppt）。将人工或天然海水通过滤膜过滤 0.22 μm 微米滤膜过滤以去除颗粒和细菌。
- 麻醉一只成年夏威夷短尾鱿鱼（Euprymna scolopes）Euprymna scolopes将动物置于含2%乙醇的FSW溶液中进行麻醉。麻醉时间约为10分钟。乌贼将停止游动，且对触碰无主动反应。此时仍应观察到由外套膜运动指示的持续呼吸作用以及色素细胞的活动。
- 将鱿鱼腹面朝上置于标准石蜡解剖盘中，用含2%乙醇的过滤海水（FSW）淹没动物。
- 使用一种标准 200 μl 移液管吸头，向后拉开漏斗和外套膜，以暴露位于两眼之间的主头静脉血管。
- 使用无菌的1 mL注射器（配26.5号针头），穿刺头静脉血管，抽取50–100 μl 血淋巴。将血淋巴置于冰上的一次性无菌1.5 mL离心管中。
注意：如果一只动物将多次作为供体，每次仅采集10-20 μl 任何时间点的血淋巴量。将动物放回正常海水水箱中，动物将在30分钟内恢复。 - 新鲜采集的血细胞经洗涤后重悬于 500 μl 的鱿鱼林格溶液（S-Ringers；530 mM NaCl，10 mM KCl，25 mM MgCl2，10 mM CaCl2 和 10 mM HEPES 缓冲液（pH 7.5）。
- 通过血细胞计数板测定血细胞浓度，将约2,000个细胞加入带腔室的玻璃盖玻片中，于室温下静置10分钟，使其贴附于玻璃表面。在此密度下，血细胞在玻片表面形成均匀的单层。
- 为了观察细菌与宿主血细胞的结合，可将血细胞暴露于荧光标记的细菌菌株，例如 费氏弧菌 ES114 和/或 Vibrio harveyi B392，均含有绿色荧光报告基因。 V. fischeri ES114 和 V. harveyi B392 在海水胰蛋白胨培养基（SWT）中培养至对数生长期中期 28°C 在摇床中孵育。通过分光光度法测定600 nm处的光密度以确定菌液浓度。将细菌以5,000 rpm离心5分钟收集菌体，弃去上清液，菌体沉淀用S-Ringers溶液重悬。
- 每个腔室孔中加入100,000个细菌细胞，使每个血细胞平均与50个细菌接触。将血细胞与细菌的混合物在S-Ringer溶液中孵育 25°C 1小时，该时间可获得最大结合水平。
- 然后用 0.005% CellTracker Orange（Invitrogen）对血细胞的细胞质进行荧光染色，并用 S-Ringers 溶液洗涤以观察细胞。
- 使用蔡司Discovery V20荧光体视显微镜或徕卡SP2光谱激光共聚焦显微镜通过荧光观察带有相关细菌的染色血细胞，并在整个动物细胞表面进行计数。
代表性结果
由于头足类血淋巴含有细胞外血蓝蛋白而非血红蛋白，因此在氧合后，血淋巴会变为深蓝色。平均每约5000个血细胞 μl 可采用此方法获取血淋巴。血细胞在腔室载玻片上贴壁并经荧光染色后，应呈现明亮的红色荧光，形态呈变形虫状。进行细菌黏附实验时， V. fischeri 与血细胞的黏附性较差（每个血细胞仅1-2个细菌细胞） V. harveyi 会牢固黏附（每个血细胞附着10-15个细菌细胞）。
图 1. 成年夏威夷短尾乌贼 Euprymna scolopes，显示头部血管的位置。
图2. 血细胞暴露于Vibrio fischeri（A）和Vibrio harveyi（B）的结果。红色：Cell Tracker Orange；绿色：GFP标记的细菌。
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讨论
近年来，关于免疫系统在有益细菌与其宿主之间介导分子信号传导作用的研究，极大地增进了我们对真核生物与其微生物群共同进化的理解。鱿鱼/弧菌系统已被证明是回答该领域基本问题的一个可行模型系统2,3,5,6,8。鱿鱼Euprymna scolopes的发光器官仅允许发光细菌Vibrio fischeri定植。由于容纳细菌的组织始终与海水接触，鱿鱼宿主不仅必须促进这种特异性共生关系，还必须持续排斥其他细菌。持续的研究表明，类似巨噬细胞的血细胞可能在该共生关系的建立和维持过程中发挥重要作用1,4,7。由于鱿鱼宿主缺乏适应性免疫系统，这种共生关系中所表现出的高度特异性必然完全或部分由先天免疫系统介导。最近对这些血细胞的一项研究表明，从E. scolopes中分离出的血细胞能够差异性地识别并吞噬V. fischeri和非共生细菌，且定植过程可能诱导了对共生菌的一种“免疫耐受”4。本实验方案将演示如何成功地从成年鱿鱼中获取这些血细胞，并检测其结合细菌的能力。
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致谢
资助来源：康涅狄格大学研究基金会及分子与细胞生物学系对 SVN 的资助，Sigma Xi 研究资助奖及 Antonio H. 和 Marjorie R.
罗曼诺研究生教育奖学金授予 AJC
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Lab-Tek 8孔腔室#1.0硼硅酸盐盖玻片系统 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 155411 | |
| 26.5 G 1ml 无乳胶胰岛素注射器 | BD Biosciences | C34551 | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen | C34551 | |
| SteREO Discovery V20 显微镜 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| SP2 共聚焦显微镜 | Leica Microsystems |
参考文献
- Koropatnick, T. A., Kimbell, J. R., McFall-Ngai, M. J. Responses of host hemocytes during the initiation of the squid-Vibrio symbiosis. Biol. Bull. 212, 29-39 (2007).
- McFall-Ngai, M. J. Unseen forces: the influence of bacteria on animal development. Dev. Biol. 242, 1-14 (2002).
- McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism. Science. 254, 1491-1494 (1991).
- Nyholm, S. V., Stewart, J. J., Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. Recognition between symbiotic Vibrio fischeri and the haemocytes of Euprymna scolopes. Environ. Microbiol. 11, 483-493 (2009).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).
- Nyholm, S. V., Stabb, E. V., Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. Establishment of an animal-bacterial association: recruiting symbiotic Vibrios from the environment. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 10231-10235 (2000).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. Sampling the light-organ microenvironment of Euprymna scolopes: description of a population of host cells in association with the bacterial symbiont Vibrio fischeri. Biol Bull. 195, 89-97 (1998).
- Visick, K. L., Ruby, E. G. Vibrio fischeri and its host: it takes two to tango. Curr. Opin. Microbiol. 9, 632-638 (2006).
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