马赛克斑马鱼转基因增强子序列，以评估

摘要

我们证明我们的方法来寻找潜在发育调控基因的增强子元件和评估它们的功能，通过镶嵌的斑马鱼转基因。

摘要

人类基因组序列的完成，以及其他许多物种，突出了把特定功能的非编码序列的挑战。由非编码的基因组的一部分进行的一个突出功能是调节基因的转录;但是，有没有有效的方法来大致预测的主要DNA序列的顺式调控元件。我们已经开发出一种高效的协议功能评估潜在的顺式调控，通过斑马鱼转基因的元素。我们的方法提供了发育的重要基因的细胞培养为基础的技术，显着的优势，因为它提供信息的空间和时间的基因调控。相反，它是更快和更昂贵的比类似的实验，在转基因小鼠，我们经常将其应用到人类基因组序列。在这里，我们证明我们的方法来测试序列克隆序列的养护和我们的协议的基础上，显微注射到斑马鱼的胚胎中选择元素。

方案

1。选型和测试的保守序列的克隆

1. 首先必须找出潜在的调控序列进行功能测试。我们依赖于进化的序列保守性作为标准来选择序列，最经常使用的算法PhastCons，这是作为跟踪UCSC基因组浏览器（http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway）访问。然而，还有许多其他可用来评估跨物种的序列保守的算法。
2. 一旦我们选择了我们的序列，设计引物扩增基因组DNA的每个序列。应选择引物扩增保守的区域再加上30个或更多的碱基对任何一方。
3. 对于选定的序列的扩增，我们使用的宝LA TaqTM系统。其他聚合酶的工作，但重要的是要使用的混合，其中包括一个与校对能力的酶，以减少放大过程中引入的错误的机会。我们核实琼脂糖凝胶电泳扩增大小。
4. 我们使用的PCR 8/GW/TOPO TA克隆试剂盒（Invitrogen）的克隆到一个条目含有attL重组位点的载体的PCR产物，生成的网关条目克隆。克隆反应是新鲜的PCR产物更有效率，所以最好是一天的PCR克隆内执行。 DH5α菌株的转化是由奇霉素抗性选择。
5. 我们验证TA克隆的产物〜500ng的质粒用EcoRI消化释放插入，并确认的琼脂糖凝胶电泳插入的大小。我们建议测序验证插入的顺序和方向，也可用于测序引物扩增。
6. 从入门克隆的保守序列，非编码穿梭LR的重组，我们的网关的准备目标向量，pGW_cfosGFP1，使用网关LR Clonase II酶混合物（Invitrogen公司）。 D....

讨论

我们已经证明，在我们的实验室用于潜在的增强剂使用斑马鱼转基因的高效分析方法。大多数情况下，我们使用这种方法，寻找与人类基因相关的组织特异性的增强剂。尽管缺乏明显的序列同源性之间的人类和鱼类非编码序列，我们发现，这种方法通常是在成功地确定我们感兴趣的基因的增强剂。成功的关键因素，正在编制的质粒DNA和RNA的转座护理，注射和检查每个构造足够数量的胚胎。转基因工程，胚胎microinjections，并镶嵌表达分析的一般方法，将适用于产生许多其他用途的转基因斑马鱼线。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Takara LA Taq	Takara Bio Inc	RR02M
pCR8/GW/TOPO TA 克隆试剂盒	Invitrogen	K2500-20
Gateway LR Clonase II 酶混合液	Invitrogen	11791-100
高效文库克隆用感受态细胞 DH5α	Invitrogen	12535-019
高效文库克隆用感受态细胞 DB3.1	Invitrogen	11782-018
mMESSAGE mMACHINE 体外转录试剂盒	Ambion	AM1340
HiSpeed 质粒中量提取试剂盒	Qiagen	12643
QIAquick PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28104
Flaming/Brown 微量移液器拉制仪	Sutter Instrument Co.	P-97
气动 PicoPump	World Precision Instruments, Inc.	SYS-PV820