用于评估增强子序列的嵌合体斑马鱼转基因技术

摘要

我们展示了如何从发育调控基因中寻找潜在的增强子元件，并通过嵌合型斑马鱼转基因技术评估其功能。

摘要

人类基因组序列以及许多其他物种基因组序列的完成，凸显了为非编码序列赋予特定功能所面临的挑战。基因组中的非编码区域一个重要功能是调控基因转录，然而目前尚无有效方法能够从初级DNA序列广泛预测顺式调控元件。我们开发了一种高效的实验方案，通过斑马鱼转基因技术对潜在的顺式调控元件进行功能评估。与基于细胞培养的技术相比，该方法在研究发育相关基因时具有显著优势，因为它能够提供基因调控在空间和时间上的信息。相反，与转基因小鼠中的类似实验相比，该方法更快且成本更低，我们常规将其应用于从人类基因组中分离出的序列。本文中，我们展示了基于序列保守性筛选待测元件的方法，以及克隆序列并将其显微注射至斑马鱼胚胎的实验流程。 关键词：基因组非编码序列，顺式调控元件，基因转录调控，斑马鱼转基因，序列保守性，功能验证，显微注射，胚胎分析

方案

1. 用于测试的保守序列的选择与克隆

1. 首先必须确定用于功能测试的潜在调控序列。我们依靠进化上的序列保守性作为选择序列的标准，最常使用的是PhastCons算法，该算法可在UCSC基因组浏览器（http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway）上以轨迹（track）形式获取。然而，目前已有多种其他算法可用于评估跨物种的序列保守性。
2. 选定序列后，我们设计引物以从基因组DNA中扩增每条序列。引物应选择用于扩增保守区域及其两侧各30个或更多碱基对的区域。
3. 为扩增所选序列，我们使用 Takara LA TaqTM 系统。其他聚合酶也可使用，但重要的是应选用包含具有校对功能酶的混合酶体系，以最大限度降低扩增过程中引入错误的几率。我们通过琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物的大小。
4. 我们使用 pCR 8/GW/TOPO TA 克隆试剂盒（Invitrogen）将 PCR 产物克隆至含有 attL 重组位点的入门载体中，以构建 Gateway 入门克隆。新鲜的 PCR 产物可提高克隆反应效率，因此最好在 PCR 完成后一天内进行克隆。随后将产物转化至 DH5α 菌株，并通过壮观霉素抗性进行筛选。
5. 通过使用 EcoRI 酶切约 500 ng 质粒以释放插入片段，并利用琼脂糖凝胶电泳确认插入片段的大小，从而验证 TA 克隆产物。我们建议通过测序验证插入片段的序列及方向；用于扩增的引物也可用于测序....

讨论

我们已展示了本实验室用于利用斑马鱼转基因技术高效分析潜在增强子的方法。通常，我们采用此方法寻找与人类基因相关的组织特异性增强子。尽管人类与鱼类的非编码序列之间大多数情况下缺乏明显的序列同源性，但我们发现该方法通常能够成功鉴定出我们感兴趣基因的增强子。成功的关键因素在于仔细制备质粒DNA和转座酶RNA，并对每种构建体注射并检测足够数量的胚胎。转基因构建、胚胎显微注射以及嵌合表达分析的一般方法也可适用于为多种其他目的构建转基因斑马鱼品系。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Takara LA Taq	Takara Bio Inc	RR02M
pCR8/GW/TOPO TA 克隆试剂盒	Invitrogen	K2500-20
Gateway LR Clonase II 酶混合液	Invitrogen	11791-100
高效文库克隆用感受态细胞 DH5α	Invitrogen	12535-019
高效文库克隆用感受态细胞 DB3.1	Invitrogen	11782-018
mMESSAGE mMACHINE 体外转录试剂盒	Ambion	AM1340
HiSpeed 质粒中量提取试剂盒	Qiagen	12643
QIAquick PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28104
Flaming/Brown 微量移液器拉制仪	Sutter Instrument Co.	P-97
气动 PicoPump	World Precision Instruments, Inc.	SYS-PV820