可利用单感器记录技术测定昆虫嗅觉感觉神经元对气味分子的电生理反应。在本视频文章中，我们将演示如何在果蝇（Drosophila melanogaster）的触角和疟疾蚊子（Anopheles gambiae）的上颚须上进行单感器记录。
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摘要
摘要
嗅觉对昆虫寻找食物、配偶、天敌以及产卵场所至关重要3。昆虫的嗅觉感觉神经元（OSNs）被包裹在称为嗅小节（sensilla）的感觉毛中，这些嗅小节覆盖在嗅觉器官的表面。每个嗅小节的表面分布着微小的孔隙，气味分子通过这些孔隙进入，并溶解于一种称为嗅小节淋巴液的液体中，该液体包围着位于嗅小节内的OSN感觉树突。OSN树突表达气味受体（OR）蛋白，在昆虫中，这些蛋白作为气味门控离子通道发挥作用4, 5。气味分子与OR的相互作用会增强或抑制OSN的基础放电频率。这种以动作电位形式呈现的神经活动，构成了气味分子在性质、强度和时间特征上的最初神经表征6, 7。
由于这些感觉毛易于接触，可通过将记录电极插入嗅觉毛淋巴液中，同时将参考电极置于昆虫眼部或体部的淋巴液内，从而对单个嗅觉感觉神经元（OSN）进行细胞外记录。在Drosophila中，每个嗅觉毛内含有1至4个OSN，但每个OSN通常表现出特征性的峰电位幅度。利用峰电位分类技术，可将放电反应归因于特定的单个OSN。这种单个嗅觉毛记录（SSR）技术通过检测嗅觉毛淋巴液与参考电极之间的电位差，记录由OSN受体活动产生的电脉冲信号1, 2, 8。对气味物质刺激后峰电位数量的变化，构成了昆虫气味编码的细胞基础。本文中，我们描述了目前本实验室用于在Drosophila melanogaster和Anopheles gambiae中进行SSR的制备方法，并展示了由气味物质诱导的、具有嗅觉毛特异性的代表性记录轨迹。
方案
1. 气味稀释
- 大多数气味物质可溶于石蜡油。然而，对于某些特殊气味，也可使用DMSO或乙醇作为替代溶剂。在玻璃小瓶中用纯气味物质配制适当稀释度的溶液（例如1:10体积比，v:v）。大多数气味稀释液在室温下稳定，但对于高挥发性化合物，建议每周配制新鲜的工作液。每个感器对不同气味的响应浓度范围各不相同。Drosophila中针对特定感器选择合适浓度的参考表可参见文献6, 7。
在本视频实验中，我们使用石蜡油作为空白溶剂对照，对Drosophila记录使用乙酸甲酯（10-6 v:v，溶于石蜡油），对Anopheles记录使用1-辛烯-3-醇（10-7 v:v，溶于石蜡油）。 - 使用剪刀将层析纸裁剪成3 mm × 5 cm的纸条，以便能够放入巴斯德吸管中。
- 用移液器吸取30 μL目标气味物质滴加到滤纸条上，并将其插入玻璃吸管中。截取约3 cm的通气管，插入吸管的开口端，并用连接头密封。该连接头用于封闭吸管，待实验中需要递送气味时，再将此吸管连接至气泵的通气管路。
2. 气味递送系统
- 使用小型电钻在一支10 mL塑料刻度吸管（例如在4 mL刻度处）进行切割，并在负1.5 mL和负0.5 mL刻度处各打一个孔，用于固定装有气味物质的吸头。将一个200 μL吸头插入带倒刺的连接器中，然后将连接器插入10 mL吸管的平头末端。该吸管将作为气味物质递送系统的一部分使用。
- 用磁力支架和吸管夹固定该吸管，并将其置于显微镜附近。
3. 电极的打磨
- 为打磨电极，配制0.5 M的氢氧化钾（KOH）溶液，并过滤以去除微小颗粒（例如使用45 μm滤膜）。取一支20 mL注射器，在靠近尖端的侧壁（距尖端约1 cm处）用针头刺一个小孔（直径约2 mm），用于插入导电导线（图1A）。
- 将0.5 M KOH溶液注入注射器中，并将其固定在显微镜下的支架上，使注射器尖端位于视野范围内（图1B、C）。将导线插入注射器壁上的小孔中（图1B），注意确保导线不直接位于注射器入口前方。将该导线连接至直流电源（例如Wild Heerbrugg MTR32，见方法部分）的阴极，或交流电源（例如Wild Heerbrugg-LEP 990018）的一个电极。将电极夹持杆安装在显微镜右侧的手动显微操作器上，并用鳄鱼夹将一根导线连接至电极夹持杆底部。将该导线连接至直流电源的阳极或交流电源的另一极（图1A）。
- 将一段钨丝（长约5 cm）插入电极夹持器中，并将其固定在操作器的电极夹持杆上。将电源调节至6 V，反复将钨丝尖端插入注射器中进行打磨，并在过程中通过显微镜密切观察尖端形态（图1C）。为获得理想的记录电极，先将电极长度的90%浸入溶液中最多1分钟，然后缓慢拉出；随后仅将约50%的电极插入溶液中进一步蚀刻30秒，重复此过程约10次，直至尖端充分变细。
电极尖端应足够细，以便插入感器内，但又不能过细，以免在记录过程中（步骤6和7）接触时发生弯曲。尽管在解剖显微镜下观察电极尖端的打磨过程可大致判断其粗细，但只有在记录显微镜的高倍放大下观察，才能明确判断某根电极是否适用于记录。
4. 昆虫准备：Drosophila 触角
- 制作一个果蝇吸管。剪取一段足够长的气管软管，使其能舒适地挂在脖子上（约 90 - 120 cm）。剪下 200 μL 枪头的尖端，并将其插入软管的一端。在另一端，放置一块约 1.5 cm × 1.5 cm 的网状材料，使其形成物理屏障，但不妨碍空气从管中流出。剪下 1 mL 枪头的尖端，并将较宽的一端置于管口上方，将网状材料夹在中间。此部分将用于吸取和操作成年醋蝇（图 2）。
- 取一张显微镜载玻片，在其长边中央位置放置一小块牙科蜡。在其上方放置盖玻片，使其略微向上倾斜（约 30°），注意蜡不要直接位于盖玻片最上端下方，以免影响在显微镜下观察醋蝇。使用垂直拉针仪拉制玻璃电极。其尖端应足够细且柔韧，以便插入第二和第三触角节之间，并在记录过程中保持触角稳定。将玻璃电极放置在另一小块蜡上，并置于盖玻片一侧，距离应足够远，使得当尖端下放时可到达盖玻片的角落（图 3A）。
- 从所需基因型的成年果蝇瓶或管中，使用果蝇吸管吸取一只成年醋蝇。尽管通常使用体型较大的雌蝇，雄蝇也可使用。在 1 mL 枪头上方放置一个 200 μL 枪头，以防止果蝇逃逸。向管中吹气，使果蝇被推至 200 μL 枪头末端。用刀片在果蝇后方数毫米处修剪枪头宽端，然后插入少量蜡以防止果蝇后退。在显微镜下，再次靠近果蝇头部进行切割，注意不要损伤果蝇。使用细小的枪头推动蜡，使果蝇头部伸出，约一半眼睛露出枪头（图 3B）。确保其腿部不会同时伸出，否则可能活动并干扰记录。
- 将果蝇固定在一块蜡上，头部朝上，放置于盖玻片前方的载玻片上。轻轻将头部推向玻璃角落，使触角伸展并贴附于玻璃表面。将玻璃毛细管尖端下放至第二和第三触角节之间（图 3B）。
- 触角的不同部位可通向不同类型的感觉毛。根据特定实验需求，需以不同方式调整触角方向，以便接触不同类型的感觉毛。如本例中记录大型锥形感觉毛时，需将刚毛向下压在玻璃上（图 3B）。
5. 昆虫样本制备：Anopheles 上颌须
- 使用电动吸气器（图2E），在小型塑料笼（图2F）中收集40至60只3至5日龄的蚊子（雌雄混合）。蚊子应在正常条件下饲养，即在25-28°C、相对湿度70-80%的昆虫培养箱或昆虫饲养室中。将装有蚊子的小型塑料笼置于冰上约15分钟，使其通过低温麻醉。待蚊子停止活动后，每次仅将4至6只蚊子转移至显微镜载物台上进行操作，其余蚊子继续保留在冰上。尽管通常使用雌蚊，因其对CO2更敏感，但雄蚊也可用于实验。根据触角结构（雌蚊为羽状，雄蚊为丝状）判断蚊子性别，并用精细镊子去除其翅膀和足，以固定蚊体。将处理后的蚊子置于底部垫有湿润滤纸的小型塑料杯中，防止其干燥。
- 在载玻片中央和侧边分别平行粘贴两段双面胶（每段长约1 cm，间距约1 cm）（图3C）。在解剖显微镜下，用精细镊子将一只蚊子放置于中央胶带上，将其侧放，并将身体及一侧复眼粘附于胶带上。调整其下颚须的位置，使两个下颚须平行伸展于胶带上（图3D）。在下颚须基部和末端处各用细线（如人发）固定（图3D）。侧边的胶带用于存放备用细线，而中央胶带每次记录后需更换（图3C）。
6. 记录黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）
- 将载玻片置于显微镜下（图4A），使用低倍镜观察，并将触角大致置于视野（FOV）中央（图4B）。轻轻降低电极，使参考电极位于果蝇眼部附近，记录电极位于触角附近（图4C）。提高放大倍数，并重新调整触角位置，使其位于视野中央（图4D）。
- 将气味递送装置靠近果蝇头部，并对准触角。
- 在低倍镜下（图4C），将参考电极插入果蝇眼部。将记录电极轻柔地置于触角表面之上，但不要接触其表面。
- 切换至高倍镜，使用显微操作器控制记录电极，并将其插入选定的感器（sensillum）中（图4D）。感器长度方向上的任意位置均适合记录。一旦电极进入感器，可进一步推进（有时可完全穿过），以获得更高的信噪比。电极进入感器后，即可检测到细胞的自发性活动。
7. 记录 Anopheles gambiae
- 将载玻片置于显微镜下低倍镜（10x）观察，使上颚须大致位于视野中央，头部位于上方（图4E）。旋转载物台，使其中一侧上颚须与记录电极呈直角。
- 调节电极高度，使参考电极位于蚊子眼睛正上方，记录电极靠近上颚须。
- 放置气味递送装置，使其尽可能接近上颚须。
- 在低倍镜（10x）下将参考电极插入眼部，切换至高倍镜（100x）后，将记录电极插入上颚须的刺形感器中（图4F）。一旦电极进入感器，即可检测到细胞的自发性电活动。
8. 典型结果
根据感受器的类型和记录质量，可以在单个记录轨迹中区分出不同数量的嗅觉神经元。例如，在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的大锥形感器中，记录过程中应出现2至4个 spike 电位幅度不同的细胞9, 10。
在我们的视频实验中， 果蝇 ab2感器包含两个细胞，即A细胞（图5，蓝色峰）和B细胞（图5，绿色峰）。在施加石蜡油时，这两个细胞均未被激活（图5A），而仅有A细胞对10-6 乙酸甲酯的稀释（图5B）。
在上颌须中 Anopheles gambiae，沟状刺形感器包含三个细胞，但其中仅有两个易于区分（图5C，分别为蓝色和绿色峰）。在视频实验中，我们展示了B细胞对10-7 1-辛烯-3-醇的稀释（图5D）。
图1. 电极拉制仪
(A) 电极拉制装置的整体视图。(B) 装有0.5 M KOH的注射器（左侧），用于 sharpen 电极（右侧）。(C) 电极尖端与注射器开口相邻的特写。
图 2. 如何制备果蝇吸管器和蚊子吸管器
(A) 起始材料：气管用塑料软管、两个剪下的移液枪头以及网筛。(B) 果蝇吸管器完成后的整体结构。(C) 果蝇吸管器用于捕捉醋蝇的一端细节。(D) 果蝇吸管器另一端的细节。(E) 用于蚊子采集的电动吸管器，由主体部分和可拆卸的塑料笼组成。(F) 蚊子用的可拆卸塑料笼。
图3. 醋蝇（Drosophila melanogaster）和疟蚊（Anopheles gambiae）记录前的准备
(A) 醋蝇固定在载玻片上、尚未置于显微镜下的照片。(B) 醋蝇头部特写，其触角由玻璃毛细管固定。(C) 蚊子固定在载玻片上的照片。(D) 蚊子头部特写，喙和须粘附在胶带上。
图 4. 醋蝇（Drosophila melanogaster）与疟蚊（Anopheles gambiae）的电生理记录
(A) 电生理实验装置示意图。(B) 安装在显微镜下的果蝇制备样品的特写。注意记录电极（左侧）、气味递送系统（中间移液管）和参考电极（右侧）的相对位置。(C) 在10倍物镜下观察的果蝇图像。(D) 在100倍物镜下观察的果蝇触角图像；粗大的锥形感器（箭头）散布于非感觉性刚毛之间（箭头所示）。(E) 用于记录的蚊子在10倍物镜下的视图。(F) 蚊子喙部及一根栓状感器（箭头）的高倍放大图像。
图5. 记录示例来自 黑腹果蝇 和 Anopheles gambiae
（A） ab2感器 黑腹果蝇 包含两个感觉神经元：A细胞（蓝色尖峰）和B细胞（绿色尖峰）。 (B) 应用 10 期间的 A 细胞和 B 细胞-6 乙酸甲酯 (C) 栓状感器 Anopheles gambiae 包含两个感觉神经元：A细胞（蓝色尖峰）和B细胞（绿色尖峰）。 (D) 10的应用-7 1-辛烯-3-醇至刺感器
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讨论
生物利用嗅觉线索来识别食物来源、潜在配偶以及捕食者。Drosophila melanogaster 和 Anopheles gambiae 的嗅觉感觉神经元（OSNs）易于获取，可在气味脉冲刺激的同时监测其电活动。这些神经元是外部刺激与大脑更高级中枢之间的首个中继站，信息将在这些中枢进一步处理。
本视频介绍的单感器记录（SSR）技术已被广泛用于记录嗅觉神经元（OSNs）并研究其对大量气味分子的电生理反应6, 7。随着嗅觉受体（ORs）的去孤儿化6, 11以及将ORs定位至黑腹果蝇（Drosophila）触角特定位置的研究进展9, 12, 13，SSR技术已成为一种强大的工具，可用于在活体（in vivo）条件下分析特定ORs的电生理特性，这是理解外部嗅觉世界如何通过OSNs转化为电信号并最终被动物感知的第一步。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 石蜡油 | 气味物质 | Fluka | 76235 | |
| 高纯度气味物质（>98%） | 气味物质 | Sigma-Aldrich | 乙酸甲酯 #296996 1-辛烯-3-醇 #74950 | |
| 滤纸条 | 气味物质 | Fisher Scientific | 05-714-1 | 色谱纸 |
| 连接器 | 气味物质 | Cole-Parmer | EW-06365-40 | 1/16x1/8" |
| 玻璃小瓶 | 气味物质 | Agilent Technologies | 5182-0556 | |
| 气路塑料管 | 气味递送 | Python Products | 500PAL | |
| 1 支移液管 | 气味递送 | Corning | 4101 | 10 mL |
| 塑料管 | 气味递送 | Cole-Parmer | EW-06418-0 | 0.050"x0.090"外径 |
| 一次性硼硅酸盐玻璃巴斯德吸管 | 气味递送 | Fisher Scientific | 13-678-20A | 5-3/4 英寸 |
| 可编程刺激控制器 | 气味递送 | Syntech | CS-55 | |
| 防震台 | 电生理设备 | TMC | 63533 | 36”宽×30”深×29”高 |
| 法拉第笼 | 电生理设备 | TMC | MI8133303 | |
| 倒置显微镜 | 电生理设备 | Nikon Instruments | E600FN ECLIPSE | 记录用显微镜 |
| 10x 和 100x 物镜 | 电生理设备 | Nikon Instruments | 10x Plan Fluor 100x L Plan | |
| 解剖显微镜 | 电生理设备 | Nikon Instruments | EZ645 | 用于电极拉制/昆虫准备的显微镜 |
| 磁力支架 | 电生理设备 | Newport Corp. | MODEL 150 | |
| IDAC | 电生理设备 | Syntech | IDAC-4 | |
| 采集软件 | 电生理设备 | Syntech | Autospike | |
| 1 台粗调操纵器 | 电生理设备 | Narishige International | MN-151 | 操纵杆式操纵器 用于定位参考电极 |
| 1 台微操纵器 | 电生理设备 | EXFO | PCS-6000 | 用于定位记录电极 |
| 鳄鱼夹 | 电生理设备 | Pomona | AL-B-12-0 | |
| 电缆 | 电生理设备 | Pomona | B-36-0 | 测试电缆组件 |
| 2 个电极夹持器 | 电生理设备 | Syntech | N/A | 钨丝电极用夹持器（2 个一套） |
| 交流探头 | 电生理设备 | Syntech | N/A | 通用单端探头（10×交流） |
| 钨电极 | 电生理设备 | Microprobes | M210 | 直型钨棒，0.005×3 |
| 氢氧化钾 | 电生理设备 | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| 注射器 | 电生理设备 | BD Biosciences | 301625 | 20 mL |
| 电源 | 电生理设备 | Wild Heerbrugg | 例如 MTR32 | |
| 垂直拉制仪 | 昆虫准备 | Narishige International | PB-7 | |
| 剃须刀片 | 昆虫准备 | VWR international | 55411-050 | |
| 牙科蜡 | 昆虫准备 | Patterson | 091-1503 | |
| 显微镜载玻片 | 昆虫准备 | Fisher Scientific | 12-550A | |
| 盖玻片 | 昆虫准备 | Fisher Scientific | 12-541A | 18×18 #1.5 |
| 聚丙烯网 | 昆虫准备 | Small Parts, Inc. | CMP-0500-B | |
| 玻璃电极 | 昆虫准备 | Frederick Haer and Co. | 27-32-0-075 | 毛细管，硼硅酸盐玻璃，外径 1.5 mm × 内径 1.12 mm × 长 75 mm |
| 双面胶带（3M） | 昆虫准备 | 3M | MMM6652P3436 | 双面胶带（3M） |
| 镊子 | 昆虫准备 | Fine Science Tools | 021x0053 | Dumont #5 镜面抛光镊子 |
| 小型塑料杯 | 昆虫准备 | VWR international | 89009-662 | 7 × 5.7（23/4 × 21/4） |
| 电动吸虫器 | 昆虫准备 | Gempler’s | RHM200 |
参考文献
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