在昆虫 Drosophila melanogaster 和 Anopheles gambiae 中进行单感器记录

摘要

可利用单感器记录技术测定昆虫嗅觉感觉神经元对气味分子的电生理反应。在本视频文章中，我们将演示如何在果蝇（Drosophila melanogaster）的触角和疟疾蚊子（Anopheles gambiae）的上颚须上进行单感器记录。

摘要

嗅觉对昆虫寻找食物、配偶、天敌以及产卵场所至关重要³。昆虫的嗅觉感觉神经元（OSNs）被包裹在称为嗅小节（sensilla）的感觉毛中，这些嗅小节覆盖在嗅觉器官的表面。每个嗅小节的表面分布着微小的孔隙，气味分子通过这些孔隙进入，并溶解于一种称为嗅小节淋巴液的液体中，该液体包围着位于嗅小节内的OSN感觉树突。OSN树突表达气味受体（OR）蛋白，在昆虫中，这些蛋白作为气味门控离子通道发挥作用^{4, 5}。气味分子与OR的相互作用会增强或抑制OSN的基础放电频率。这种以动作电位形式呈现的神经活动，构成了气味分子在性质、强度和时间特征上的最初神经表征^{6, 7}。

由于这些感觉毛易于接触，可通过将记录电极插入嗅觉毛淋巴液中，同时将参考电极置于昆虫眼部或体部的淋巴液内，从而对单个嗅觉感觉神经元（OSN）进行细胞外记录。在Drosophila中，每个嗅觉毛内含有1至4个OSN，但每个OSN通常表现出特征性的峰电位幅度。利用峰电位分类技术，可将放电反应归因于特定的单个OSN。这种单个嗅觉毛记录（SSR）技术通过检测嗅觉毛淋巴液与参考电极之间的电位差，记录由OSN受体活动产生的电脉冲信号^{1, 2, 8}。对气味物质刺激后峰电位数量的变化，构成了昆虫气味编码的细胞基础。本文中，我们描述了目前本实验室用于在Drosophila melanogaster和Anopheles gambiae中进行SSR的制备方法，并展示了由气味物质诱导的、具有嗅觉毛特异性的代表性记录轨迹。

方案

1. 气味稀释

1. 大多数气味物质可溶于石蜡油。然而，对于某些特殊气味，也可使用DMSO或乙醇作为替代溶剂。在玻璃小瓶中用纯气味物质配制适当稀释度的溶液（例如1:10体积比，v:v）。大多数气味稀释液在室温下稳定，但对于高挥发性化合物，建议每周配制新鲜的工作液。每个感器对不同气味的响应浓度范围各不相同。Drosophila中针对特定感器选择合适浓度的参考表可参见文献^{6, 7}。
   
   在本视频实验中，我们使用石蜡油作为空白溶剂对照，对Drosophila记录使用乙酸甲酯（10^-6 v:v，溶于石蜡油），对Anopheles记录使用1-辛烯-3-醇（10^-7 v:v，溶于石蜡油）。
2. 使用剪刀将层析纸裁剪成3 mm × 5 cm的纸条，以便能够放入巴斯德吸管中。
3. 用移液器吸取30 μL目标气味物质滴加到滤纸条上，并将其插入玻璃吸管中。截取约3 cm的通气管，插入吸管的开口端，并用连接头密封。该连接头用于封闭吸管，待实验中需要递送气味时，再将此吸管连接至气泵的通气管路。

2. 气味递送系统

1. 使用小型电钻在一支10 mL塑料刻度吸管（例如在4 mL刻度处）进行切割，并在负1.5 mL和负0.5 mL刻度处各打一个孔，用于固定装有气味物质的吸头。将一个200 μL吸....

讨论

生物利用嗅觉线索来识别食物来源、潜在配偶以及捕食者。Drosophila melanogaster 和 Anopheles gambiae 的嗅觉感觉神经元（OSNs）易于获取，可在气味脉冲刺激的同时监测其电活动。这些神经元是外部刺激与大脑更高级中枢之间的首个中继站，信息将在这些中枢进一步处理。

本视频介绍的单感器记录（SSR）技术已被广泛用于记录嗅觉神经元（OSNs）并研究其对大量气味分子的电生理反应^{6, 7}。随着嗅觉受体（ORs）的去孤儿化^{6, 11}以及将ORs定位至黑腹果蝇（Drosophila）触角特定位置的研究进展^{9, 12, 13}，SSR技术已成为一种强大的工具，可用于在活体（in vivo）条件下分析特定ORs的电生理特性，这是理解外部嗅觉世界如何通过OSNs转化为电信号并最终被动物感知的第一步。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
石蜡油	气味物质	Fluka	76235
高纯度气味物质（>98%）	气味物质	Sigma-Aldrich		乙酸甲酯 #296996 1-辛烯-3-醇 #74950
滤纸条	气味物质	Fisher Scientific	05-714-1	色谱纸
连接器	气味物质	Cole-Parmer	EW-06365-40	1/16x1/8"
玻璃小瓶	气味物质	Agilent Technologies	5182-0556
气路塑料管	气味递送	Python Products	500PAL
1 支移液管	气味递送	Corning	4101	10 mL
塑料管	气味递送	Cole-Parmer	EW-06418-0	0.050"x0.090"外径
一次性硼硅酸盐玻璃巴斯德吸管	气味递送	Fisher Scientific	13-678-20A	5-3/4 英寸
可编程刺激控制器	气味递送	Syntech	CS-55
防震台	电生理设备	TMC	63533	36”宽×30”深×29”高
法拉第笼	电生理设备	TMC	MI8133303
倒置显微镜	电生理设备	Nikon Instruments	E600FN ECLIPSE	记录用显微镜
10x 和 100x 物镜	电生理设备	Nikon Instruments	10x Plan Fluor 100x L Plan
解剖显微镜	电生理设备	Nikon Instruments	EZ645	用于电极拉制/昆虫准备的显微镜
磁力支架	电生理设备	Newport Corp.	MODEL 150
IDAC	电生理设备	Syntech	IDAC-4
采集软件	电生理设备	Syntech	Autospike
1 台粗调操纵器	电生理设备	Narishige International	MN-151	操纵杆式操纵器 用于定位参考电极
1 台微操纵器	电生理设备	EXFO	PCS-6000	用于定位记录电极
鳄鱼夹	电生理设备	Pomona	AL-B-12-0
电缆	电生理设备	Pomona	B-36-0	测试电缆组件
2 个电极夹持器	电生理设备	Syntech	N/A	钨丝电极用夹持器（2 个一套）
交流探头	电生理设备	Syntech	N/A	通用单端探头（10×交流）
钨电极	电生理设备	Microprobes	M210	直型钨棒，0.005×3
氢氧化钾	电生理设备	Sigma-Aldrich	221473
注射器	电生理设备	BD Biosciences	301625	20 mL
电源	电生理设备	Wild Heerbrugg	例如 MTR32
垂直拉制仪	昆虫准备	Narishige International	PB-7
剃须刀片	昆虫准备	VWR international	55411-050
牙科蜡	昆虫准备	Patterson	091-1503
显微镜载玻片	昆虫准备	Fisher Scientific	12-550A
盖玻片	昆虫准备	Fisher Scientific	12-541A	18×18 #1.5
聚丙烯网	昆虫准备	Small Parts, Inc.	CMP-0500-B
玻璃电极	昆虫准备	Frederick Haer and Co.	27-32-0-075	毛细管，硼硅酸盐玻璃，外径 1.5 mm × 内径 1.12 mm × 长 75 mm
双面胶带（3M）	昆虫准备	3M	MMM6652P3436	双面胶带（3M）
镊子	昆虫准备	Fine Science Tools	021x0053	Dumont #5 镜面抛光镊子
小型塑料杯	昆虫准备	VWR international	89009-662	7 × 5.7（23/4 × 21/4）
电动吸虫器	昆虫准备	Gempler’s	RHM200