生物系统中用于氧成像的磷光纳米探针的合成与标定

摘要

我们介绍了基于磷光猝灭的氧气检测原理，并综述了用于生物系统中氧气成像的卟啉类树状纳米传感器的设计。

摘要

通过磷光猝灭法测量氧气[1, 2]包括以下步骤：1）将探针导入目标介质中（例如血液或组织间液）；2）用适当波长的光照射样品，使探针激发至其三重态；3）收集发射的磷光信号，并分析其时间过程以获得磷光寿命，再将其转换为氧浓度（或氧分压，pO₂). 探针不得与生物环境发生相互作用，并且在某些情况下，测量完成后需能从介质中排出。上述每个步骤都对磷光探针的分子设计提出了要求，而这类探针是测量过程中唯一的侵入性组分。本文综述了用于生物体系中氧气检测的树枝状磷光纳米传感器的设计。这些探针由基于铂（Pt）或钯（Pd）卟啉的聚芳甘氨酸（AG）树枝状聚合物构成，其外围经聚乙二醇（PEG）残基修饰。为了实现有效的双光子激发，可在树枝状分子的末端修饰双光子天线发色团，该发色团可捕获激发能量，并通过分子内FRET（Förster共振能量转移）将能量传递至探针的三重态核心。我们描述了探针的关键光物理特性，并提供了详细的校准方案。

方案

1. 氧气测量方案的一般描述

（本部分无需实际操作，但对理解论文其余部分至关重要。可以将其拍摄成一系列幻灯片，例如几页Power Point，并配以解说声音。）

1.1）将探针递送至目标介质中，例如注射到动物的血液或组织间液中。

1.2) 用适当波长的光照射样品（组织表面），以促使探针进入激发三重态。通常激发发生于 通过 单光子机制。然而，对于特殊的双光子增强探针，激发可以进行 通过 双光子机制，可实现探针在高分辨率显微成像中的应用。单光子激发通常空间分辨率较低，但所需仪器更简单，且可用于基于LED的光纤磷光计进行单点测量。

1.3) 探针发出的磷光来源于长寿命的三重态。探针分子必须经过特殊设计，以实现高三重态的量子产率，并发射磷光而非荧光。当处于三重态时，探针可能与氧分子发生碰撞，导致三重态失活，这一过程称为“猝灭”。在无氧条件下，三重态的寿命即磷光衰减寿命为 τ₀。在有氧条件下，由于猝灭作用，磷光寿命（τ）会缩短。三重态寿命与环境中氧的含量之间存在直接关系。这种关系即著名的 Stern-Volmer 关系，它将磷光寿命（τ）与氧浓度 [O₂]（或氧分压 pO₂）关联起来：

在生物系统中，氧气是迄今为止最有效的磷光猝灭剂，这使得磷光猝灭法对氧气具有很高的选择性。

1.4) 为了测量寿命 t，需对发射的磷光光子进行时间上的分箱。例如，在激发脉冲之后，前 15 微秒内可能收集到 200 个光子，接下来的 15 微秒内收集到 150 个光子，依此类推，直至不再收集到光子。将各时间箱中的光子数对时间作图，即可得到磷光衰减曲线，通过分析该曲线可获得寿命 τ。在成像过程中，此方法应用于图像的每一个像素，从而生成磷光寿命分布图。寿命测量对探针在整个样品中分布不均的情况不敏感，而这种不均在生物样品中十分常见。因此，寿命信号仅反映氧气状态。寿命 τ 通过 Stern-Volmer 关系式转换为氧气浓度。

2. 磷光探针的构建

用于生物体系中氧气检测的磷光探针由磷光发色团（核心）组成，这些发色团被封装在由树状大分子——高度规整的超支化聚合物[3]——构建的笼状结构中。树状大分子可保护核心免受环境相互作用的影响，并调控氧气向核心扩散的速率，从而优化探针的灵敏度和动态范围（即Stern-Volmer关系中的常数k_q）。树状大分子的末端被化学惰性的亲水性聚乙二醇（PEG）基团修饰，使探针具有高度水溶性，并防止其与生物大分子发生相互作用。

探针的磷光核心为卟啉或π-扩展卟啉的铂（Pt）或钯（Pd）配合物。π-扩展卟啉是指吡咯环与外部芳香片段稠合的卟啉。通过π-扩展可调节探针的光谱特性，以满足特定成像应用的需求（例如显微成像与断层成像）。作为示例，我们描述了四芳基四苯并卟啉钯（PdAr₄TBP）的合成方法[4]。PdAr₄TBP在光谱的远红区具有强吸收带和强烈的磷光，非常适合用于生物体系中的氧气检测。

PdAr的合成₄TBP 的步骤包括以下内容：

2.1) 通过Lindsey缩合反应[5]，将四氢异吲哚与取代苯甲醛缩合制备四芳基四环己烯卟啉（Ar4TCHP）。在四氢异吲哚（1当量）的CH中0.01 M溶液中₂CL₂ 在氩气氛围下加入芳香醛（1 当量）。反应混合物于室温避光搅拌 10 分钟。BF₃xEt₂O（0.2 当量）加入后，反应混合物在室温下继续搅拌 2 小时。随后加入 DDQ（1 当量），混合物在持续搅拌下静置过夜。反应液用 10% 水合 Na 溶液洗涤₂SO₃，10% 水溶液 Na₂CO₃，5% 水合盐酸，最后用饱和食盐水洗涤。有机相用 Na₂SO₄ 干燥₂SO₄，然后在真空下浓缩。残留物用CH重结晶₂Cl₂ - 叔丁基-丁基醚混合物以得到Ar₄TCHP 为绿色粉末，产率约为 50%。

2.2）插入 Pd 以获得 PdAr₄TCHPs。将游离碱卟啉（1 当量）与 PdCl₂ 或 Pd(OAc)₂（1.2 当量）在过量 Et₃N（20 当量）存在下，于回流的 CH₃CN 中反应。通过紫外-可见光谱法（溶剂为 CH₂Cl₂-AcOH）监测反应进程，当 468–472 nm 处的 Soret 带完全消失时，认为反应完成。反应混合物冷却后，用 CH₂Cl₂ 稀释，并通过一层薄薄的硅藻土过滤以除去 Pd(0)。蒸发溶剂后，残留物通过硅胶柱层析纯化，以 CH₂Cl₂ 作为洗脱溶剂。收集深红色馏分，蒸发溶剂后几乎定量地得到目标产物 PdAr₄TCHPs。

2.3) PdAr₄TBP通过PdAr的氧化制备₄在回流的THF中，使用过量2倍的DDQ（16当量）处理TCHPs。回流过程中，溶液颜色由深红色变为深绿色。蒸发溶剂后，将残余物用CH稀释₂Cl₂，用10%水溶液Na洗涤₂SO₃，水和盐水。有机相用Na干燥₂SO₄ 并在真空下浓缩。残余物通过硅胶柱层析纯化（洗脱剂：CH₂Cl₂）。收集第一份深绿色组分，减压浓缩，得到85-90%的PdAr4TBP，呈蓝绿色粉末。

2.4) 使用10倍过量的KOH在1%（v/v）水/四氢呋喃中于室温下水解Pd四[3,5-二丁氧羰基苯基]四苯并卟啉（PdAr4TBP）的外围酯基。将生成的PdAr4TBP羧酸衍生物钾盐沉淀析出后，倾去溶剂。固体溶于水，继续搅拌2小时，用浓盐酸酸化至pH~4-5。所得沉淀通过离心分离，用水洗涤，并在真空下干燥。

保护树枝状结构（dendron）。 树状大分子的每一个独立分支称为 dendron。保护树枝状结构由芳基甘氨酸（AG）构建单元构成。AG 树枝状结构可由廉价起始原料简便合成，并通过无需色谱纯化的手段以高纯度和高收率获得。第二代（G2）AG-树枝状结构的合成包括以下步骤：

2.4）采用 Fischer 卤代酰卤法合成砌块：Boc 保护的 3,5-二羧基苯基甘氨酸酰胺和 3,5-二丁氧羰基苯基甘氨酸酰胺。

2.5）使用 CDMT/NMM 肽偶联化学法偶联结构单元。

2.6）在室温下将 G2 树枝状分子溶液在三氟乙酸（TFA）中搅拌 2 小时，以脱除焦点氨基的保护基。

2.7）对于高代数树状大分子的组装，需重复进行偶联/脱保护步骤。

树状大分子组装通过HBTU/DIPEA偶联反应将脱保护的树状支化单元与PdAr4TBP（或其他卟啉）偶联而实现。

2.8）首先，从树枝状分子上除去 Boc 保护基团。例如，将 Boc 保护的 G3 树枝状分子（0.58 g）溶于 TFA（15 ml）中，混合物在室温下反应 2 小时。通过旋转蒸发除去酸，得到 TFA 盐形式的树枝状分子。将残余物溶于干燥的 NMP（10 ml）中，并加入几滴 DIPEA 以淬灭残留的 TFA。

2.9）在开始偶联反应之前，必须将卟啉完全溶解。例如，将四羧基苯基卟啉铂（0.061 g）溶于65 ml无水NMP中，在氮气氛围下加热至140°C并搅拌10分钟。

2.10）将溶液冷却至室温，加入 HBTU（0.211 g），混合物搅拌反应 5 分钟。

2.11) 将DIPEA（0.35 ml）一次性加入混合物中，立即随后加入树状分子的TFA盐在NMP中的溶液（见2.8），混合物在搅拌下静置过夜。

2.12) 将混合物倒入3%水溶液NaCl（350 ml）中，离心收集析出的沉淀，并依次用水、MeOH和Et洗涤。₂通过反复悬浮/离心获得目标卟啉-树状大分子。

2.13) 为了水解外围的酯基，首先将树状大分子在 DMSO/MeOH 中用 NMe₄OH（约 5 mM）处理 20–60 分钟，随后完全除去溶剂。该步骤可使树状大分子生成足够数量的羧酸根，从而获得水溶性。为完成水解，再将树状大分子用 0.1N 的水相 NaOH 处理（过夜）。最终，可分离得到纯的卟啉-树状大分子羧酸，产率为 80–95%。

树枝状大分子外围的修饰。 在此阶段，从相同的卟啉-树枝状大分子出发，可合成单光子或双光子探针。在前一种情况下，所有外围的羧基均被聚乙二醇（PEG）单元修饰，该方法称为PEG化。在后一种情况下，首先将若干羧基与经乙二胺（EDA）连接基修饰的双光子天线发色团（香豆素-343）偶联，随后对剩余的羧基进行PEG化修饰[6]。树枝状大分子使用单甲氧基寡乙二醇胺（m-PEG-NH₂，平均分子量1000）通过HBTU/DIPEA偶联反应实现PEG化。

2.14) 将 HBTU 以 1.25 倍摩尔过量加入到树形分子的 NMP（或 DMF）溶液（1–10 mM）中，室温下搅拌反应混合物 10 分钟。随后加入 6.25 倍摩尔过量的 DIPEA，立即再加入 1.25 倍摩尔过量的 m-PEG-NH2。反应混合物在室温下继续搅拌 2 天。向反应混合物中加入乙醚，通过离心分离析出的沉淀，并将沉淀物用乙醚在 THF 中再次沉淀。

2.15）通过收集第一前缘相，采用尺寸排阻色谱法实现最终纯化。将聚乙二醇化的卟啉-树状大分子溶解于少量四氢呋喃（~15 ml）中，加样至填充有聚苯乙烯尺寸排阻相（Biorad，Biobeads S-X1）的色谱柱顶部。用纯四氢呋喃洗脱色谱柱，收集随溶剂前沿移动的深色条带。

2.16）在旋转蒸发仪上除去 THF，并将剩余物质在真空下干燥。

3. 探针表征

光物理表征包括在生理条件下测量探针的吸收光谱和发射光谱、磷光寿命τ₀以及 Stern-Volmer 氧猝灭常数k_q。

3.1) 使用标准仪器（分光光度计和稳态荧光光谱仪），在常温常压条件下测定探针的吸收光谱和发射光谱。探针溶液浓度约为 1 μM。

3.2）接下来，获得 Stern-Volmer 校准曲线。这是最重要的测量步骤，因为它使我们能够将探针的寿命与氧气浓度关联起来。

3.3）将探针的PBS缓冲液（pH 7.2）溶液置于特制的圆柱形比色皿中，将比色皿放入控温腔室内，该腔室位于不透光的屏蔽箱内，箱体设有激发光和发射光光纤的接口。在腔室内，光纤以直角几何构型紧贴比色皿放置。

3.4）将比色皿用塞子封闭，塞子上插入一个高灵敏度的克拉克型氧电极（CK-氧电极）。塞子上还设有两个针孔端口，用于氩气的进气和出气。电极浸入溶液中，而针孔仅用于在溶液表面之上通入气体。最初，进气口不连接氩气。

3.5）将温度设定至所需值（通常为36-37°C），溶液在搅拌条件下静置以达到平衡。

3.6）激发光纤连接至由计算机控制的数字磷光计的激发端口。磷光计中的光源为高功率LED，其输出由333 kHz的D/A板控制。发射光纤连接至磷光计的另一个光学端口，该端口耦合至一个对红外光高度敏感的APD（雪崩光电二极管）。二极管的输出信号经过放大后输入同一控制板的A/D通道，从而实现激发通道与发射通道之间的同步。

3.7) 控制软件可生成任意所需长度的激发脉冲（例如 5 或 10 ms），随后在任意选定的时间段内（通常为 2-3 ms）采集磷光衰减信号。单次寿命测量所需时间通常为 0.5-1 s，但测量速度可快至每秒 10-20 次。

3.8）氧电极的输出信号被放大后，输入同一台计算机上的另一块A/D板卡。该板卡为低频板卡（最高1 kHz），用于在选定的时间段内记录电极电流。记录电极数据的程序与磷光仪软件同时运行。

3.9）当溶液温度达到平衡后，同时启动磷光计和电极程序，每10秒进行一次测量。两者的输出结果被同步记录到两个独立的文件中。随后，将氩气连接至比色皿塞子的进气口。

3.10) 当氩气流过搅拌溶液的表面时，会逐渐取代其中的氧气。这导致电极电流下降，同时磷光寿命增加，磷光寿命由磷光计测定。通常情况下，经过约 2 小时后，溶液中的氧气可被完全置换，此期间数据会全自动记录到文件中。

3.11) 滴定运行结束后，将电极数据和磷光寿命导入标准分析软件（例如 Microcal Origin）。电极电流与氧浓度呈线性关系，对于所用的电极，在无氧条件下其电流实际为零。在大气压下，pO₂ 已知（约为 150 mm Hg）。因此，可将电极数据直接转换为氧浓度标度，并绘制磷光寿命的倒数与 pO₂ 的关系图。采用最小二乘法对该图进行直线拟合，其斜率即为氧猝灭常数 kq。磷光寿命 t0 可通过同一拟合结果获得（取截距的倒数），或直接从无氧条件下的测量结果中获得。

3.12) 如有需要，可使用探针在白蛋白存在下的溶液重复滴定实验——白蛋白是血浆中浓度较高的蛋白质，以此模拟真实实验体系（动物体内血液）中的条件。in vivo 实验获得的 Stern-Volmer 图应完全一致，前提是树状大分子能有效保护探针，且 PEG 基团可将探针与白蛋白隔离。否则，探针将与血液中的蛋白质发生相互作用，导致 Stern-Volmer 图发生变化，从而引起氧浓度测量结果的不确定性。

因此获得的校准常数用于成像实验中，以测定氧气浓度 先验的 未知。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
N-甲基吡咯烷酮			NMP
三氟乙酸			TFA
二异丙基乙胺			DIPEA
2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐			HBTU
二甲基亚砜			DMSO
CDMT=1-氯-3,5-二甲氧基三嗪			CDMT
NMM=N-甲基吗啉			NMM