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方法文章

多色流式细胞术分析恒河猴的细胞免疫应答

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DOI：

10.3791/1743

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2010年4月22日

 ,  ,  , 
1Department of Immunology, MD Anderson Cancer Center - University of Texas, 2Department of Medicine, University of Miami

本文内容

摘要

我们展示了多色流式细胞术在恒河猴中对CD4+和CD8+ T细胞的总群体及其记忆亚群进行详细表型和功能特征分析的应用价值，恒河猴是进行艾滋病疫苗研究的理想模型。

摘要

食蟹猴模型目前是研究艾滋病病毒-艾滋病发病机制以及疫苗和治疗药物开发的最佳可用模型。1,2,3. 本文介绍了一种用于详细分析细胞免疫应答表型与功能的方法，特别是针对 CD4+ 和 CD8+ T 细胞及其各自记忆亚群的细胞内细胞因子产生情况。我们通过使用佛波酯（PMA）联合离子霉素（ionomycin, PMA+I）刺激恒河猴外周血单个核细胞（PBMC），精确测定了 CD4+ 和 CD8+ T 细胞中干扰素γ（INF-γ）和白细胞介素（IL）-2 产生的定量与定性指标。不同记忆T细胞亚群的细胞因子谱存在差异。此外，该方案具有足够灵敏度，可检测经本实验室研发的HIV包膜肽混合疫苗免疫后的恒河猴PBMC样本中极少量的抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞亚群。多色流式细胞术是一种精确鉴定T细胞不同亚群的强大工具4,5具有产生细胞因子的能力6非特异性或抗原特异性刺激后5,7.

方案

对总T细胞及其记忆亚群进行详细表型和功能分析的步骤可分为四个部分：1）细胞准备与抗原刺激，2）表面标志物染色，3）细胞内细胞因子染色，以及4）流式细胞术分析。

1. 细胞准备与抗原刺激

  1. 本方案中使用了新鲜分离以及冻存的外周血单个核细胞（PBMC）。PBMC 通过 Ficoll-Hypaque 密度梯度离心法（Histopaquen-1077，Sigma-Aldrich，ST. Louis，MO）从恒河猴肝素化或枸橼酸抗凝的静脉血样本中分离获得。PBMC 分装后以 90% 胎牛血清和 10% 二甲基亚砜保存于液氮中。
  2. 使用冻存 PBMC 时，将冻存管从液氮中取出，在 37 °C 水浴中迅速解冻，轻柔混匀，用 RPMI-1640 培养基（HyClone Laboratories，Logan，UT）洗涤以去除冻存液，重悬于完全培养基 [CM；RPMI-1640 加 10% 热灭活胎牛血清（HyClone Laboratories）、2 mM L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich）、100 U/ml 青霉素/链霉素（Invitrogen）]，并在 37 °C、湿润的 5% CO2 环境中接种于 6 孔组织培养板中过夜培养。次日早晨，采用台盼蓝染色排除法测定活细胞数量，并将细胞重悬于完全培养基中。
  3. 细胞根据非特异性刺激与抗原特异性刺激的不同方式进行处理，随后进行细胞因子分析：（a）非特异性刺激使用佛波酯 12-肉豆蔻酸 13-乙酸酯（PMA）和离子霉素（I）（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO），取 0.1 ml 细胞悬液（每孔 1.0 × 106 个细胞）接种于 96 孔组织培养板（BD Biosciences，Franklin Lake，NJ）的各个孔中。PMA 和离子霉素的终浓度分别为 50 ng/ml 和 500 ng/ml。96 孔组织培养板每孔的终体积为 0.2 ml；（b）抗原特异性刺激时，将 1.0 × 106 个细胞溶于 1.0 ml 体积中接种于 24 孔组织培养板（BD Biosciences，Franklin Lake，NJ）的各个孔中，其中各孔已按先前方法稍作修改进行预处理9。简言之，24 孔组织培养板每孔加入 2.5 μg/ml 的山羊抗小鼠 IgG（H + L）抗体（Kierkegaard and Perry Laboratory，Gaithersburg，MD）溶于 50 mM Tris 溶液（pH 8.6）中，4 °C 包被过夜。次日早晨用无菌 PBS 洗涤两次，每孔加入共刺激单克隆抗体 CD49d（克隆号 9F10，BD Biosciences；San Jose，CA），终浓度为 10 μg/ml，37 °C 孵育 1 小时。孵育后，室温下用无菌 PBS 洗涤两次。加入目标抗原（包括六种 HIV 包膜肽的混合物8），每种肽的终浓度为 10 μg/ml。另设仅含完全培养基的细胞孔作为阴性对照。24 孔组织培养板每孔的终体积为 1.0 ml。
  4. 细胞在 37 °C、湿润的 5% CO2 环境中培养 6 小时。在刺激的最后 4.5 小时，向培养体系中加入布雷菲德菌素 A（Brefeldin A，Sigma-Aldrich，St. Louis，MO），终浓度为 10 μg/ml。随后将细胞转移至 5 ml 聚丙烯管中，用冷（4 °C）流式洗涤缓冲液（不含 Ca2/Mg2 的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS；Life Technologies，Rockville，MD）加 2% 热灭活胎牛血清）洗涤，然后进行后续荧光标记抗体染色处理。

2. 免疫荧光表面标志物染色

  1. 刺激后的细胞首先在4°C避光条件下，用1 µL活/死可固定Aqua荧光反应性染料染色30分钟，然后用冷流式洗涤缓冲液洗涤一次。
  2. 随后，向细胞中加入以下经适当滴定的荧光标记单克隆抗体：抗CD3 PE-Cy7（SP34-2）、抗CD8 Alexa700（RPA-T8）、抗CD28 PerCP-cy5.5（L293）、抗CD95 APC（DX2）和抗CD4 Pacific Blue（OKT4），上述抗体均购自BD Biosciences（Franklin Lakes, NJ），其中CD4 Pacific Blue（OKT4）来自eBioscience（San Diego, CA）。细胞在4°C避光孵育30分钟。
  3. 每次实验均使用补偿对照和荧光减一（FMO）对照10,11。补偿对照用于确定每种单独染料对其他检测通道的溢出系数。补偿对照管中，采用来自一只猴子的细胞悬液，分别单独使用荧光偶联的单克隆抗体进行单色染色。FMO是指包含所有染料但缺少目标染料的多色染色组合，用于通过复制完全染色样本中的自发荧光水平和背景信号，确定阳性与阴性细胞群之间的界限。
  4. 染色后的细胞用冷流式洗涤缓冲液洗涤，随后在固定/破膜溶液（BD Biosciences；San Jose, CA）中固定至少10分钟（此步骤中细胞可在4°C避光条件下保存过夜），然后进行胞内细胞因子染色。

3. 胞内细胞因子染色

  1. 固定后的细胞用流式洗涤缓冲液洗涤，然后根据生产商的说明书加入破膜/洗涤缓冲液（BD Biosciences；San Jose, CA）。简言之，细胞在0.1 ml的1×破膜/洗涤缓冲液中于4°C避光孵育10分钟。
  2. 随后，细胞在4°C避光条件下与适当滴定浓度的FITC标记抗IFN-γ抗体（B27）和PE标记抗IL-2抗体（MQ1-17H12）孵育60分钟。
  3. 然后用破膜溶液再洗涤细胞两次。
  4. 最后一次洗涤后，细胞重悬于含1%多聚甲醛的DPBS中，并在24小时内进行流式细胞术分析。

4. 流式细胞术分析

  1. 使用 LSR II 流式细胞仪（BD Biosciences；San Jose, CA）或 CyAn ADP（Dako, Carpinteria, CA）获取染色后的细胞。流式细胞术数据采用 FlowJo 软件（Tree Star, Ashland, OR）进行分析。
  2. 图 1 展示了用于分析代表性动物中不同 T 细胞亚群的设门策略。首先通过前向散射光（FSC）与侧向散射光（SSC）圈选淋巴细胞，随后根据 SSC 及活细胞染料阴性群体确定活淋巴细胞。接着通过 CD3 表达阳性鉴定 T 细胞，然后在 CD3+ T 细胞群体中进一步识别 CD4+ CD8-（CD4+ T 细胞）和 CD4- CD8+（CD8+ T 细胞）亚群。根据文献报道5, 10，CD4+ 和 CD8+ T 细胞再依据 CD28 和 CD95 的表达进一步划分为不同亚群：初始型（Tn, CD28+ CD95-）、中央记忆型（Tcm, CD28+ CD95+）和效应记忆型（Tem, CD28- CD95+）细胞。
  3. 图 2 展示了如何评估 CD4+ 和 CD8+ T 细胞不同亚群在 PMA 与离子霉素（PMA+I）刺激下产生细胞因子（INF-γ 和/或 IL-2）的功能能力。

5. 代表性流式细胞术数据

采用流式细胞术分析确定了食蟹猴外周血单个核细胞（PBMC）的组成。图1展示了来自一只代表性动物的不同T细胞亚群分析所使用的设门策略。首先通过前向散射光（FSC）与侧向散射光（SSC）对淋巴细胞进行设门，随后根据SSC及Aqua染料阴性群体确定活淋巴细胞。接着通过CD3的表达鉴定T细胞，并在CD3+ T细胞群体中进一步确定CD4+ CD8-（CD4+ T细胞）和CD4- CD8+（CD8+ T细胞）亚群。如图2所示，根据CD28和CD95的表达情况，将CD4+和CD8+ T细胞进一步划分为不同的亚群：初始型（Tn, CD28+ CD95-）、中央记忆型（Tcm, CD28+ CD95+）和效应记忆型（Tem, CD28- CD95+）细胞。图2A展示了未刺激及PMA/离子霉素刺激条件下CD4+ T细胞及其各亚群中INF-γ和IL-2的产生情况，图2B展示了相同条件下CD8+ T细胞及其各亚群中INF-γ和IL-2的产生情况。请注意，各亚群经刺激后表现出不同的细胞因子谱型。

流式细胞术设门图 CD3+, CD8+, CD4+；T细胞、淋巴细胞分析、免疫谱型分析。
图1. 用于恒河猴外周血单个核细胞（PBMC）组成流式细胞术分析的设门策略。请点击此处查看图1的放大版本。

流式细胞术图显示T细胞亚群；PMA/ION刺激下IL-2和IFN标志物分析。
流式细胞术点图；IL-2对比IFN-γ；T细胞亚群；PMA/IONO刺激组与对照组。
图2. (A) 总CD4+ T细胞及其亚群的细胞因子产生谱。(B) 总CD8+ T细胞及其亚群的细胞因子产生谱。请点击此处查看图2a的放大版本，或点击此处查看图2b的放大版本。

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致谢

Pramod Nehete 博士和 Bharti Nehete 女士提供了猕猴血液和外周血单个核细胞（PBMC）样本；本研究部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目 AI 46969 的资助，所有细胞培养基均由中央培养基实验室制备，该实验室由 NIH 基金项目 CA 16672 资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论

溶液与缓冲液

    <李>Ficoll-Hypaque（Histopaquen-1077，Sigma-Aldrich，St. Louis，MO） <李>RPMI-1640 培养基（HyClone Laboratories，Logan，UT） <李>胎牛血清（FBS），（HyClone Laboratories，洛根，犹他州） <李>L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich；St. Louis, MO） <李>青霉素/链霉素（Invitrogen；Carlsbad, CA） <李>台盼蓝试剂（Sigma-Aldrich；St. Louis, MO） <李>50 mM Tris，pH 8.6；过滤后于4℃保存 °C <李>杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS，无钙无镁；Life technologies，Rockville，MD） <李>流式洗涤缓冲液：含2% FBS的DPBS，4℃保存 °C <李>BD Cytofix/Cytoperm 固定/破膜溶液试剂盒（BD Biosciences；美国加利福尼亚州圣何塞）

激活剂

    <李>佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO） <李>Ionomycin（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO）
  • 共刺激单克隆抗体 CD49d，克隆株 9F10（BD Biosciences；加利福尼亚州圣何塞）
    • <李>山羊抗小鼠 IgG（H+L）抗体 F(ab')2 片段（经亲和纯化），Kierkegaard 和 Perry 实验室（美国马里兰州盖瑟斯堡） <李>特异性激活剂可包括肽段混合物、单个肽段或完整蛋白质

细胞因子分泌抑制剂

    <李>布雷菲德菌素A（Brefeldin A，BFA，Sigma-Aldrich，St. Louis，MO） <李>Golgi Plug 可替代使用（BD Biosciences；San Jose, CA）

抗体

    <李>活/死可固定蓝色荧光染色试剂盒（Invitrogen；Carlsbad，CA） <李>CD3 PE-Cy7（SP34-2），（BD Biosciences；San Jose，CA） <李>CD4 太平洋蓝（OKT4），eBiosciences（美国加利福尼亚州圣地亚哥） <李>CD8 Alexa700（RPA-T8），（BD Biosciences；San Jose，CA） <李>CD28 PerCP-cy5.5（L293）（BD Biosciences；San Jose, CA） <李>CD95 APC（DX2）（BD Biosciences；San Jose，CA） <李>IFN- FITC (B27)，（BD Biosciences；San Jose，CA） <李>IL-2 PE（MQ1-17H12），（BD Biosciences；San Jose，CA）

参考文献

  1. Ogg, G. S. Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA. Science. 279, 2103-2106 (1998).
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  9. Baumgarth, N., Roederer, M. A. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243, 77-97 (2000).
  10. De Rosa, S. C., Herzenberg, L. A., Roederer, M. 11-color 13-parameter flow cytometry: identification of human naive T cells by phenotype, function, and T-cell receptor diversity. Nat Med. 7, 245-248 (2001).
  11. Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A. New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data. Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).

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