多色流式细胞术分析恒河猴的细胞免疫应答

摘要

我们展示了多色流式细胞术在恒河猴中对CD4+和CD8+ T细胞的总群体及其记忆亚群进行详细表型和功能特征分析的应用价值，恒河猴是进行艾滋病疫苗研究的理想模型。

摘要

食蟹猴模型目前是研究艾滋病病毒-艾滋病发病机制以及疫苗和治疗药物开发的最佳可用模型。^1,2,3. 本文介绍了一种用于详细分析细胞免疫应答表型与功能的方法，特别是针对 CD4+ 和 CD8+ T 细胞及其各自记忆亚群的细胞内细胞因子产生情况。我们通过使用佛波酯（PMA）联合离子霉素（ionomycin, PMA+I）刺激恒河猴外周血单个核细胞（PBMC），精确测定了 CD4+ 和 CD8+ T 细胞中干扰素γ（INF-γ）和白细胞介素（IL）-2 产生的定量与定性指标。不同记忆T细胞亚群的细胞因子谱存在差异。此外，该方案具有足够灵敏度，可检测经本实验室研发的HIV包膜肽混合疫苗免疫后的恒河猴PBMC样本中极少量的抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞亚群。多色流式细胞术是一种精确鉴定T细胞不同亚群的强大工具^4,5具有产生细胞因子的能力⁶非特异性或抗原特异性刺激后^5,7.

方案

对总T细胞及其记忆亚群进行详细表型和功能分析的步骤可分为四个部分：1）细胞准备与抗原刺激，2）表面标志物染色，3）细胞内细胞因子染色，以及4）流式细胞术分析。

1. 细胞准备与抗原刺激

1. 本方案中使用了新鲜分离以及冻存的外周血单个核细胞（PBMC）。PBMC 通过 Ficoll-Hypaque 密度梯度离心法（Histopaquen-1077，Sigma-Aldrich，ST. Louis，MO）从恒河猴肝素化或枸橼酸抗凝的静脉血样本中分离获得。PBMC 分装后以 90% 胎牛血清和 10% 二甲基亚砜保存于液氮中。
2. 使用冻存 PBMC 时，将冻存管从液氮中取出，在 37 °C 水浴中迅速解冻，轻柔混匀，用 RPMI-1640 培养基（HyClone Laboratories，Logan，UT）洗涤以去除冻存液，重悬于完全培养基 [CM；RPMI-1640 加 10% 热灭活胎牛血清（HyClone Laboratories）、2 mM L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich）、100 U/ml 青霉素/链霉素（Invitrogen）]，并在 37 °C、湿润的 5% CO₂ 环境中接种于 6 孔组织培养板中过夜培养。次日早晨，采用台盼蓝染色排除法测定活细胞数量，并将细胞重悬于完全培养基中。
3. 细胞根据非特异性刺激与抗原特异性刺激的不同方式进行处理，随后进行细胞因子分析：（a）非特异性刺激使用....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
溶液与缓冲液
<李>Ficoll-Hypaque（Histopaquen-1077，Sigma-Aldrich，St. Louis，MO） <李>RPMI-1640 培养基（HyClone Laboratories，Logan，UT） <李>胎牛血清（FBS），（HyClone Laboratories，洛根，犹他州） <李>L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich；St. Louis, MO） <李>青霉素/链霉素（Invitrogen；Carlsbad, CA） <李>台盼蓝试剂（Sigma-Aldrich；St. Louis, MO） <李>50 mM Tris，pH 8.6；过滤后于4℃保存 °C <李>杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS，无钙无镁；Life technologies，Rockville，MD） <李>流式洗涤缓冲液：含2% FBS的DPBS，4℃保存 °C <李>BD Cytofix/Cytoperm 固定/破膜溶液试剂盒（BD Biosciences；美国加利福尼亚州圣何塞）
激活剂
<李>佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO） <李>Ionomycin（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO） 共刺激单克隆抗体 CD49d，克隆株 9F10（BD Biosciences；加利福尼亚州圣何塞） <李>山羊抗小鼠 IgG（H+L）抗体 F(ab')2 片段（经亲和纯化），Kierkegaard 和 Perry 实验室（美国马里兰州盖瑟斯堡） <李>特异性激活剂可包括肽段混合物、单个肽段或完整蛋白质
细胞因子分泌抑制剂
<李>布雷菲德菌素A（Brefeldin A，BFA，Sigma-Aldrich，St. Louis，MO） <李>Golgi Plug 可替代使用（BD Biosciences；San Jose, CA）
抗体
<李>活/死可固定蓝色荧光染色试剂盒（Invitrogen；Carlsbad，CA） <李>CD3 PE-Cy7（SP34-2），（BD Biosciences；San Jose，CA） <李>CD4 太平洋蓝（OKT4），eBiosciences（美国加利福尼亚州圣地亚哥） <李>CD8 Alexa700（RPA-T8），（BD Biosciences；San Jose，CA） <李>CD28 PerCP-cy5.5（L293）（BD Biosciences；San Jose, CA） <李>CD95 APC（DX2）（BD Biosciences；San Jose，CA） <李>IFN- FITC (B27)，（BD Biosciences；San Jose，CA） <李>IL-2 PE（MQ1-17H12），（BD Biosciences；San Jose，CA）