植物生物质是一种主要的碳中性可再生资源，可用于生物燃料的生产。植物生物质主要由细胞壁组成，是一种结构复杂的复合材料，称为木质纤维素。本文介绍了一种对多酚类木质素含量和组分进行综合分析的实验方案。
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摘要
摘要
工业和社会对可再生、碳中和及可持续原材料的需求已成为21世纪最紧迫的问题之一。这重新激发了人们将植物产品用作工业原料以生产交通用液体燃料的兴趣1以及其他产品，例如生物复合材料7. 植物生物质仍然是地球上最大的未开发资源之一4. 它主要由细胞壁组成，细胞壁中含有富含能量的聚合物，包括纤维素、多种半纤维素（基质多糖）以及多酚类木质素6因此有时被称为木质纤维素类物质。然而，植物细胞壁在进化过程中形成了抗降解的特性，因为细胞壁可为细胞及整个植物提供抗张强度，抵御病原体侵袭，并实现水分在植物体内的运输；对于树木而言，甚至可将水分输送到距地面超过100米的高处。由于细胞壁具有多种功能，不同植物物种以及同一植物内不同细胞类型的细胞壁在结构上表现出极大的多样性。4因此，根据生物炼制所使用的作物种类、作物品种或植物组织的不同，需要对化学/酶法解聚以及后续将各种糖类发酵为液体生物燃料的加工步骤进行调整和优化。这一事实凸显了对植物生物质原料进行充分表征的必要性。本文介绍一种全面的分析方法，可用于测定木质纤维素的组成，并适用于中高通量分析。在本方法的第一部分中，我们重点分析多酚类物质——木质素（图1）。该方法首先制备脱淀粉的细胞壁材料，然后将所得的木质纤维素样品进行分步处理，通过乙酰溴溶解法测定其木质素含量3，及其按丁香基、愈创木基和对羟基苯基单元划分的木质素组成5. 第二部分讨论了分析木质纤维素生物质中碳水化合物的方案，包括纤维素含量和基质多糖组成的分析2.
方案
1. 细胞壁分离
- 使用 iWall 研磨与分配机器人（30 秒），在 2 ml Sarstedt 螺旋盖管中用 5.5 mm 不锈钢珠粗略研磨约 60–70 mg 的风干或冷冻干燥植物材料。第二部分2介绍了使用球磨机（retschmill）的替代性非机器人低通量操作流程。
- 向已分配的研磨材料中加入 1.5 ml 70% 水性乙醇，并充分涡旋振荡。
- 在 10,000 rpm 条件下离心 10 分钟，使醇不溶性残渣沉淀。
- 吸除或倾倒上清液。
- 向残渣中加入 1.5 ml 氯仿/甲醇（1:1 v/v）溶液，并充分振荡试管以重新悬浮沉淀。
- 在 10,000 rpm 条件下离心 10 分钟，吸除或倾倒上清液。
- 用 500 μl 丙酮重新悬浮沉淀。
- 在 35°C 条件下用气流吹干溶剂至干燥。
如需，干燥样品可在室温下保存，直至进一步处理。 - 为启动样品中淀粉的去除，将沉淀重新悬浮于 1.5 ml 0.1 M pH 5.0 的醋酸钠缓冲液中。
- 盖紧 Sarstedt 管，在加热块中 80°C 加热 20 分钟。
- 将悬浮液在冰上冷却。
- 向沉淀中加入以下试剂：35 μl 0.01% 叠氮化钠（NaN3）、35 μl 淀粉酶（50 μg/mL H2O；来源于 Bacillus 属，Sigma）；17 μl 普鲁兰酶（17.8 单位，来源于 Bacillus acidopullulyticus；Sigma）。盖紧管盖并充分涡旋振荡。
- 将悬浮液在 37°C 摇床中过夜孵育。将试管水平放置有助于改善混合效果。
- 在加热块中 100°C 加热 10 分钟以终止消化反应。
- 离心（10,000 rpm，10 分钟），弃去含有可溶性淀粉的上清液。
- 通过加入 1.5 ml 水、涡旋振荡、离心并倾去洗涤水，重复洗涤剩余沉淀三次。
- 用 500 μl 丙酮重新悬浮沉淀。
- 在 35°C 条件下用气流吹干溶剂至干燥。必要时可用刮勺在管内将材料打散，以促进更充分干燥。
干燥后的材料即为分离得到的细胞壁（木质纤维素类）。如需，干燥样品可在室温下保存，直至进一步处理。
2. 木质素含量
该方法基于Fukushima和Hatfield报道的方法3。
- 称取 1 - 1.5 mg 已制备的细胞壁材料（参见步骤 1）至 2 ml 容量瓶中，留出一个试管作为空白对照。
- 用 250 μl 丙酮冲洗管壁，使细胞壁材料聚集于管底，然后在气流下轻轻蒸发丙酮。
- 沿管壁缓慢加入 100 μl 新配制的乙酰溴溶液（25% v/v 乙酰溴溶于冰醋酸中），以防止溅出。
- 盖紧容量瓶，于 50°C 加热 2 小时。
- 再继续加热 1 小时，每 15 分钟涡旋混匀一次。
- 置于冰上冷却至室温。
- 加入 400 μl 2 M 氢氧化钠溶液和 70 μl 新配制的 0.5 M 盐酸羟胺溶液，涡旋混匀各容量瓶。
- 用冰醋酸定容至容量瓶 2.0 ml 刻度线，盖紧后反复倒置数次以充分混匀。
- 取 200 μl 溶液转移至适用于紫外检测的 96 孔板中，使用酶标仪在 280 nm 处读取吸光度。
- 使用适当的校正系数（杨树 = 18.21；禾本科植物 = 17.75；Arabidopsis = 15.69）按以下公式计算乙酰溴可溶性木质素百分比（%ABSL）：
% ABSL 计算：
将 %ABSL 乘以 10 可得以 μg/mg 细胞壁为单位的结果。
建议至少进行三次孔板检测以取吸光度（abs）平均值，因为颗粒物可能导致吸光度值轻微波动。注意：0.539 cm 表示光程，但根据所用孔板的不同，可能需要实际测定该值。
3. 木质素组成
本方法借鉴自 Robinson 和 Mansfield 最近发表的一项方法5。
- 将约 2 mg 的细胞壁材料（参见步骤 1）转移至用于硫代酸解的螺旋盖玻璃管中。
- 小心配制 2.5% 三氟化硼二乙醚络合物（BF3）和 10% 乙硫醇（EtSH）的溶液。需使用充满氮气的气球补偿二氧六环瓶中因取液而减少的体积。二氧六环具有高度危险性，不得将样品或设备移出通风橱。每份样品所需配制溶液体积为：175 μl 二氧六环；20 μl EtSH；5 μl BF3。
- 向每个样品中加入 200 μl 的 EtSH、BF3 和二氧六环混合溶液。
- 用氮气吹扫反应管顶空后立即加盖密封。
- 在 100°C 下加热反应 4 小时，期间每小时轻轻混匀一次。
- 将反应管置于冰上冷却 5 分钟以终止反应。
- 加入 150 μl 的 0.4 M 碳酸氢钠溶液，涡旋混匀。
- 纯化步骤：加入 1 ml 水和 0.5 ml 乙酸乙酯，涡旋混匀后静置分层（上层为乙酸乙酯，下层为水）。
- 将 150 μl 乙酸乙酯层转移至 2 ml Sarstedt 管中，注意避免带入水相。
- 使用空气浓缩仪蒸发溶剂。
- 加入 200 μl 丙酮并蒸发（重复一次，共两次），以去除过量水分。
- 进行 TMS 衍生化：向每根管中加入 500 μl 乙酸乙酯、20 μl 吡啶和 100 μl N,O-双(三甲基硅基)乙酰胺。
- 在 25°C 下孵育 2 小时。
- 将 100 μl 反应液转移至 GC/MS 进样瓶中，并加入 100 μl 丙酮。
- 使用配备四极杆质谱仪或火焰离子化检测器的气相色谱仪进行分析。色谱柱为安捷伦 HP-5MS 柱（30 mm × 0.25 mm × 0.25 μm 膜厚）。采用以下温度梯度程序，溶剂延迟 30 分钟，载气流速为 1.1 ml/min：初始温度 130 °C 保持 3 分钟；以 3 °C/min 升温至 250 °C，保持 1 分钟；随后平衡回初始温度 130 °C。
- 通过四二十四烷内标（可选）的相对保留时间，或通过 S、G 和 H 单体特征质谱离子（分别为 m/z 299、m/z 269 和 m/z 239）鉴定色谱峰（见图 2）。通过将总峰面积设为 100%，定量分析木质素组分的组成。
4. 典型结果
图2展示了一个细胞壁分析的示例。在此案例中，杨树茎秆（木材）按照方案部分所述的各种步骤进行了分析。图中显示了硫代酸解和TMS衍生化后木质素组分分离的色谱图实例。显然，可以确定丁香基（S）、愈创木基（G）和对羟基苯基（H）单元的相对丰度。乙酰溴可溶性木质素含量的概念不言自明，其值通常占细胞壁干重的20-50%。需要注意的是，乙酰溴并不能溶解细胞壁中全部的木质素，其溶解程度可能因材料不同而有所变化。然而，该方法操作相对简便、快速，能够对木质纤维素材料中的木质素含量提供良好的估算结果。
图1：木质纤维素分析概览。 从粗制干燥的植物材料中分离细胞壁（木质纤维素）。将壁材料称重后分装成等分试样，用于各项测定。壁材料经乙酰溴处理，通过紫外光谱法定量溶解的木质素。为测定木质素组成，将壁材料进行硫代酸解处理。溶解的酚类物质经TMS衍生化后，可通过气相色谱-质谱（GC-MS）分析进行分离和定量。基质多糖组成及结晶纤维素含量的测定方法见第二部分2。
图 2：杨树木材的全面木质纤维素分析。 对杨树（Populus tremoloides）的木屑进行如上所述的分析流程。
木质素组成；H p-羟基苯基；G 愈创木基；S 紫丁香基单元。
讨论
所述方法可实现对木质纤维素类植物生物质中木质素含量和组分的快速定量评估。利用 iWall 机器人，每天可研磨并分配约 350 个样品。不同分析方法的每人日通量有所不同。根据此处描述的实验方案，每人每天可处理 30 个样品用于测定木质素含量，15 个样品用于测定木质素组分。由于数据具有定量特性，可据此评估最优的原料作物、品种或基因型在生物燃料生产中的适用性。
致谢
我们感谢Matthew Robert Weatherhead提供的出色技术服务，以及威斯康星大学John Ralph提供的宝贵建议、讨论和杨树木粉样品。本工作由美国能源部（DOE）大湖生物能源研究中心（DOE BER科学办公室 DE-FC02-07ER64494）和美国能源部科学办公室基础能源科学办公室化学科学、地球科学与生物科学部（项目编号DE-FG02-91ER20021）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 盐酸羟胺 | Sigma-Aldrich | 255580 | |
| 乙酰溴 | Aldrich | 135968 | |
| 乙硫醇 | Sigma-Aldrich | E3708 | |
| 三氟化硼二乙醚络合物 | Fluka | 15719 | |
| N,O-双(三甲基硅基)乙酰胺 | Fluka | 15241 | |
| 二氧六环 | Sigma-Aldrich | 296309 | |
| Spectromax Plus 384 | Molecular Devices | Plus384 | |
| GC-MS | Agilent Technologies | 6890 GC/5975B MSD | （木质素组成） |
| 5.5 mm 不锈钢球 | Salem Ball Company | (N/A) | |
| 96 孔板散热板 | Biocision | Coolsink 96F | |
| 加热块 | Techne | Dri-block DB-3D | |
| 样品浓缩仪 | Techne | FSC400D |
参考文献
- Carroll, A., Somerville, C. Cellulosic Biofuels. Annual Review of Plant Biology. 60, 165-165 (2009).
- Foster, C. E., Martin, T., Pauly, M. Comprehensive compositional analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass), Part II: Carbohydrates. J Vis Exp. , (2010).
- Fukushima, R. S., Hatfield, R. D. Extraction and isolation of lignin for utilization as a standard to determine lignin concentration using the acetyl bromide spectrophotometric method. J. Agric. Food Chem. 49 (7), 3133-3133 (2001).
- Pauly, M., Keegstra, K. Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels. Plant J. 54 (4), 559-559 (2008).
- Robinson, A. R., Mansfield, S. D. Rapid analysis of poplar lignin monomer composition by a streamlined thioacidolysis procedure and near-infrared reflectance-based prediction modeling. Plant J. 58 (4), 706-706 (2009).
- Somerville, C. Toward a systems approach to understanding plant-cell walls. Science. 306 (5705), 2206-2206 (2004).
- Teeri, T. T., Brumer, H. Discovery, characterization and applications of enzymes from the wood-forming tissues of poplar: Glycosyl transferases and xyloglucan endo-transglycosylases. Biocatalysis and Biotransformation. 21, 173-173 (2003).
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