本视频方案展示了Johansen实验室用于制备Drosophila多线染色体以进行抗体标记的压片技术。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
果蝇长期以来一直是研究染色质结构与基因调控关系的首选模式系统，这得益于三龄幼虫唾液腺中巨大多线染色体所提供的细胞学优势。在此组织中，染色体经历多轮DNA复制而无细胞分裂，从而形成约1000个拷贝。每次复制后DNA仍保持平行排列，形成显著增大的染色体，为将染色质形态与特定蛋白质的定位相关联提供了独特机会。因此，人们高度关注在不同基因及转录过程不同阶段存在的表观遗传修饰。此类研究的重要工具之一，是利用针对特定酶、转录因子或组蛋白修饰的抗体对多线染色体进行标记。本视频方案展示了Johansen实验室用于制备果蝇多线染色体以进行抗体标记的压片技术。
方案
以下多线染色体压片制备方案改编自Johansen et al. (2009)中描述的实验步骤。
1. 三龄Drosophila幼虫的培养
为了获得高质量的唾液腺多线染色体压片，必须采用宽松的培养条件（例如，在标准的4英寸果蝇培养瓶中放入约20只产卵雌蝇，并每天更换至新瓶）。从第一批爬行的三龄幼虫中挑选最肥大的个体，选择时机应在其仍处于游走阶段但即将化蛹之前。我们通常在21°C下培养，但若在18°C下培养，可获得更粗大的染色体，这在某些情况下可能更为合适，例如需要高分辨率观察染色体带与间带区域时。
2. 多线体压片材料
- 德拉蒙德解剖镊（2 把）
- 培养皿（60 × 15 mm）
- 磨砂载玻片（Fisher No. 12-544-3）（多聚赖氨酸包被）
- 22 × 22 mm No. 15 盖玻片（Fisher No. 12-520B）（Sigmacote 包被；Sigma #SL2）
- 22 × 40 mm No. 15 盖玻片（Fisher No. 12-530B）
- 吸水纸（Kim-wipes）
- 配备 20X 物镜的相差显微镜
- 小型杜瓦瓶（例如真空瓶或保温瓶）
- 长镊子
- 刀片
- 考普林瓶（Coplin Jar）
- 橡胶密封盒或特百惠托盘（或同等可密封托盘）
- Parafilm（切成 22 mm 的正方形）
- 175 g 砝码
3. 固定剂和溶液
- 5倍甲醛储备液。将0.74 g多聚甲醛溶于4.0 ml去离子水（dH2O）中，并加入28 μl 1N KOH。加热至65°C以溶解多聚甲醛，随后置于冰上保存。
- 固定液1。取0.5 ml 10倍磷酸盐缓冲液（10X PBS）、50 μl Triton X-100、3.45 ml去离子水（dH2O）和1.0 ml 5倍甲醛储备液，新鲜配制。稍加热以分散Triton X-100，并在1小时内使用。
- 固定液2。取1.5 ml去离子水（dH2O）、2.5 ml冰醋酸和1.0 ml 5倍甲醛储备液，新鲜配制，并在1小时内使用。
- 乳酸醋酸溶液。取1 ml乳酸、2 ml去离子水（dH2O）和3 ml醋酸混合配制。
4. 多线染色体压片制备：
- 用清水冲洗幼虫，然后转移至组织培养皿中的磷酸盐缓冲液（PBS）内以进行解剖。
- 用一对镊子夹住口钩的尖端，另一对镊子夹住虫体约三分之二处，向后牵拉口钩，使唾液腺暴露。将唾液腺与脑组织及眼触角盘分离，并剔除附着在腺体上的脂肪体及其他相关组织。
- 向双孔凹玻片的第一孔中加入200微升固定剂1，向第二孔中加入200–300微升固定剂2。每次转移一对唾液腺至第一孔中的固定剂1中，根据目标表位所需时间进行孵育，通常约为1–2分钟。（注意：某些表位，如大多数组蛋白修饰，可能需要5分钟或更长时间的固定。）
- 用镊子将唾液腺转移至2号孔中的固定液2中，孵育2分钟。
- 将腺体转移至10-30 μl 在洁净的Sigmacote包被盖玻片上滴加乳乙酸溶液。轻轻将一张经多聚赖氨酸包被的显微镜载玻片覆于盖玻片上，不施加垂直压力，将盖玻片拾起，使腺体位于载玻片与盖玻片之间。 立即 用镊子轻轻夹住盖玻片的一边，小心地前后轻微移动，以促进细胞裂解和染色体铺展，注意尽量减少对组织的垂直压力。也可使用铅笔的橡皮头，甚至指尖，轻轻前后移动盖玻片。需注意，若延迟进行盖玻片的前后移动，染色体臂的铺展效果可能降低，因为暴露于乳酸乙酸溶液后染色体结构趋于僵硬。溶液出现浑浊通常是细胞分离的良好征象。用铅笔橡皮头在盖玻片上斜向轻敲数次（避免垂直压力）也可能有助于染色体的铺展。
- 立即在相差显微镜下使用20或40倍物镜检查组织，以确定染色体是否分散良好。
- 当染色体铺展充分后，将盖玻片朝下的载玻片置于一叠干净的吸水纸（Kim-wipes）上。在上方再覆盖一张吸水纸，用拇指压住盖玻片所在位置，用力按压以压平染色体，注意避免盖玻片发生水平移动，以防剪切染色体。
- 在显微镜下再次检查载玻片，以确定制片是否适用于预期目的。若压片过程中染色体发生明显移动，则在后续制片中减少乳酸乙酸溶液的使用量。重复步骤4.1–4.8，直至获得足够数量的合适载玻片。在载玻片的盖玻片上放置175 g的重物。
- 将小型杜瓦瓶（例如保温瓶）装满液氮。使用长柄镊子将载玻片浸入液氮中2 直至沸腾停止，取出载玻片，并立即用干净剃须刀片的边缘从一角将盖玻片掀去。若载玻片需立即使用，则放入盛有PBS的考普林瓶中 4°C否则将载玻片收集至装有95%乙醇的考普林瓶中。待冰霜升华后检查盖玻片，确认组织已黏附于载玻片而未留在盖玻片上。重复上述步骤处理其余载玻片，直至所有载玻片均储存于磷酸盐缓冲液（PBS，用于数小时内使用）或乙醇（用于长期保存）中。
代表性结果
获得高质量多线体染色体压片的首要关键步骤是培养具有粗大幼虫和大型唾液腺细胞核的幼虫。第二个关键是掌握良好的染色体铺展操作技术，这可能需要一定的练习。提高铺展成功率的一个技巧是在压片步骤中找到乳酸乙酸溶液的最小使用量。这将促进染色体充分铺展，同时避免产生过强的液流力量，防止染色体臂被冲走。还需注意的是，在盖玻片来回移动操作上的任何延迟都会降低染色体臂的铺展效果，因为染色体在乳酸乙酸溶液中暴露时间越长会变得越僵硬。
如果操作顺利，应能观察到大量分散良好的多线染色体。图1展示了这种制备样本的一个示例，其中用绿色标记间带区域，用蓝色染料染色带状区域。如果染色体展开不足，则染色体会呈现为小团状，如图2所示。相反，如果展开过度，染色体会变得过于细长，甚至在某些情况下断裂成小片段，如图3所示。
图1. 多线染色体压片经JIL-1组蛋白H3S10激酶抗体（红色）和Hoechst（蓝色）双重标记。
图 2. 染色体展开不充分的多线体压片。
图 3. 压片过度展开的多线体染色体标本。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
在传统的压片固定方案中加入乙酸和乳酸有助于提高染色体带间区的分辨能力以及染色体臂的伸展程度，但遗憾的是某些抗原表位在此处理过程中无法保留。H3S10ph 就是这类表位的一个例子（Cai et al., 2008）。由于酸处理还会淬灭GFP标签蛋白的内在荧光，DiMario et al.（2006）近期开发了一种基于甲醛的“无酸压片技术”，该技术无需使用GFP抗体标记即可直接观察融合GFP蛋白在多线染色体上的定位，同时还能用于检测对酸敏感的抗原表位。Johansen et al.（2009）对该方法的改进步骤进行了更详细的描述。图1展示了一个经酸固定处理的多线染色体压片样本，使用针对JIL-1组蛋白H3S10激酶的抗体与Hoechst进行双重标记的代表性结果。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
感谢 V. Lephart 女士对果蝇品系的维护。本工作得到美国国立卫生研究院基金（GM62916）和美国国家科学基金会基金（MCB0817107）的支持。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
参考文献
- Cai, W., Bao, X., Deng, H., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. RNA polymerase II-mediated transcription at active loci does not require histone H3S10 phosphorylation in Drosophila. Development. 135, 2917-2925 (2008).
- DiMario, P., Rosby, R., Cui, Z. Direct visualization of GFP-fusion proteins on polytene chromosomes. Dros. Inf. Serv. 89, 115-118 (2006).
- Johansen, K. M., Cai, W., Deng, H., Bao, X., Zhang, W., Girton, J., Johansen, J. Methods for studying transcription and epigenetic chromatin modification in Drosophila polytene chromosome squash preparations using antibodies. Methods. 48, 387-397 (2009).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
