本方案描述了一种用于上皮细胞与细菌同时且局部共培养的微流控共培养模型。该模型可用于研究不同可溶性分子信号在发病机制中的作用，以及筛选潜在益生菌菌株的有效性。
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本文内容
摘要
摘要
人体胃肠道（GI）道是一个独特的环境，其中肠上皮细胞与非致病性（共生）细菌共存。有研究提出，病原体在共生菌层中所接触的微环境对其定植程度具有重要影响。目前用于研究病原体定植的培养方法并不适用于验证这一假说，因为它们无法以模拟胃肠道微环境的方式实现细菌与上皮细胞的共培养。本文描述了一种微流控共培养模型，该模型可实现真核细胞与细菌的独立培养，并可用于检测共生微环境对病原体定植的影响。该共培养模型通过构建一个共生菌Escherichia coliHeLa 细胞间的生物膜，随后引入肠出血性大肠杆菌E. coli（EHEC）定植到共生菌岛中，这一序列模拟了胃肠道感染中的事件顺序。
方案
1. 使用标准SU-8光刻技术制备硅模板1 (本视频中未展示).
- 在洁净室中，采用标准的 SU-8 光刻工艺制备 SU-8 “母模”（SU-8 2050，MicroChem，Newton，MA），用于制造不同部件（不同厚度的 PDMS 膜、共培养室）。此类母模可在任意微加工设施中制备（例如，斯坦福微流控工坊；http://thebigone.stanford.edu/foundry/）。
- 在进行 PDMS 复型前，将 SU-8 母模置于连接真空源的干燥器中，暴露于氟硅烷蒸气，以促进 PDMS 从母模上顺利脱模。将一滴氟硅烷滴加至纸巾上，并抽真空 1 分钟。随后释放真空，静置 30 分钟以完成氟硅烷沉积。将 SU-8 母模保存于密闭容器中以备后续使用。
2. 以SU-8模具为模板的PDMS复制模塑2
- 流体层和控制层通过在SU-8模具上复制成型PDMS制备。
- 按10:1（重量比）混合PDMS预聚物与交联剂，并在真空干燥器中脱气1小时（或直至PDMS混合物中的气泡完全去除）。
- 将SU-8模具置于培养皿中，小心地将PDMS混合物倾倒于其表面，再次对PDMS进行脱气。
- 以1200 rpm转速旋转模具1分钟，使PDMS在模具上形成约100μm的均匀厚度。
- 将含有PDMS和SU-8模具的培养皿在80°C下加热1小时，使PDMS固化。
- 从加热板上取下已固化的、带有PDMS的SU-8模具。
- 将PDMS模具从SU-8模具上剥离下来。
- 使用20号钝头针在PDMS模具上钻四个孔，分别用于两个细菌入口、一个出口和一个气动端口。
3. 多层PDMS装置的键合：该装置由三层组成——包含主通道的上层、中间的气动层，以及包含细菌通道的底层。这三层结构的组装方法如下所述。
- 用甲醇润湿PDMS膜，并使用洁净的镊子小心地从SU-8模具上剥离。将膜放置在聚四氟乙烯（teflon）片上。
- 将气动膜和流体层放入氧气等离子体腔室中。开启等离子体处理40秒（氧气压力10 sccm，射频功率100 W）。
- 经等离子体处理后，在10分钟内使用镊子将膜与底部PDMS通道对齐。在膜和PDMS层上添加甲醇有助于层间自由移动，使对齐更方便。此时，将装置置于纱布上，以允许甲醇蒸气逸出。
- 将对齐后的PDMS层在80°C的加热板上固化8小时。
- 在将气动膜键合到底层后，重复步骤3.2–3.4，将顶部通道键合到已组装的复合PDMS装置上。
4. 组装PDMS装置3,4
- 在用于接种真核细胞和细菌的进样口和出样口处钻孔。
- 将Tygon管（外径0.01英寸）连接至端口，并通过拉动20 mL注射器操作气动层。
- 将PDMS模型和一块预先清洁的玻片放入氧气等离子体腔室中。在不施加真空的情况下，开启等离子体20秒（氧气流速20 sccm，射频功率300 W）。
- 为防止岛状壁（PDMS）在与玻片键合时发生接触，应立即在装置上连接注射器，并通过拉动注射器并保持其位置施加真空。
- 在两分钟内轻轻将PDMS模型压在玻片上。
- 将PDMS装置在80°C下固化10分钟。
5. 用纤连蛋白处理玻璃表面
- 连接所有端口的Tygon管后，将装置置于紫外线下灭菌15分钟。
- 向通道中注入并流过已灭菌的PBS，以清除通道内的任何碎片。持续灌流10分钟以去除气泡。由于PDMS具有透气性，气泡可轻易逸出。
- 向气动通道中注入染色液，以防止通道内形成气泡。
- 为促进真核细胞在玻璃表面的接种，向装置中引入1 μg/mL的纤连蛋白溶液，并在37°C下孵育40分钟。
- 用1 mL培养基清洗未结合的纤连蛋白。
6. 共生性 E. coli 生物膜在微岛中的形成与测定
- 在M9最小培养基中稀释共生细菌（例如 E. coli BW25113/pCM18），使其OD600约为1，用于在封闭腔室/微岛中形成共生生物膜。
- 通过施加正向液体压力封闭微岛壁。使用自制的气液压力转换装置，以防止通道内产生气泡。
- 在阀门关闭的情况下将共生性 E. coli 引入微岛，并在32°C下孵育1小时，使细菌附着。
- 洗去未附着的细菌，并以0.25 mL/hr的流速灌注稀释的细菌悬液（OD600~0.05），持续12小时。
- 用新鲜的DMEM培养基冲洗生物膜，去除松散附着的细菌，为真核细胞附着做准备。
- 使用Leica TCS SP5共聚焦激光扫描显微镜（Bannockburn, IL）对生物膜成像，并利用IMARIS软件5可视化生物膜结构。
7. 在细菌岛周围接种真核细胞6-8
- 用胰蛋白酶消化贴壁的HeLa细胞，从细胞培养瓶中解离后重悬于DMEM培养基中，调整细胞密度至5 × 105 个细胞/mL。
- 使用Picoplus注射泵（Harvard Apparatus, MA）以2 mL/min的流速将HeLa细胞注入装置中。确保微岛壁处于下降位置，使细菌生物膜区域与HeLa细胞区域相互分离。此步骤应在光学显微镜载物台上进行，以便观察细胞接种的均匀性。
- 夹闭细胞出口以减少通道内细胞悬液的流动，并在37°C、5% CO2培养箱中孵育6小时。
- 以0.5 mL/hr的流速向装置中灌注新鲜培养基，以清除未贴壁的细胞。
- 每6小时更换一次HeLa细胞和共生大肠杆菌（E. coli）的DMEM培养基。
8. 将病原菌引入微岛并使其暴露于真核细胞
- 准备 E. coli O157:H7（EHEC）以感染复数（m.o.i.）100:1 至 200:1（每 HeLa 细胞对应的 EHEC 数量）感染 HeLa 细胞。
- 冲洗并洗去松散附着的共生细菌。
- 加入稀释的EHEC悬液（OD600 ~ 0.1）进入岛屿。
- 将装置孵育于 37°C 在5% CO2 在无流动条件下于培养箱中孵育6小时，使EHEC暴露于共生生物膜中存在的信号分子。
- 抬起 PDMS 壁，使共生物岛屿中的 EHEC 暴露于 HeLa 细胞 6 小时。
- 用 PBS 冲洗通道，然后使用活/死细胞染色试剂盒（L3224，Invitrogen，CA）对活细胞和死细胞进行染色。
- 在蔡司Axiovert 200M荧光显微镜上对多个位点进行成像，并估算活细胞与死细胞的数量。
9. 典型结果 9
通过建立HeLa细胞单层和共生大肠杆菌（E. coli）生物膜，并在感染HeLa细胞前将肠出血性大肠杆菌（EHEC）暴露于该共生生物膜，模拟了胃肠道感染的事件顺序。图1展示了微流控共培养模型构建的各个步骤。图2A显示了共培养装置的三维结构示意图。图2B用不同颜色的染料（真核细胞区域为紫色，细菌岛为绿色）标示出共培养装置中的两个区域——真核细胞培养腔和细菌岛。图2C利用染料显示了将细菌培养区域与周围真核区域隔离的可行性。图3展示了上皮细胞与细菌共培养的代表性结果。图3A显示EHEC（红色）在共生生物膜（绿色）形成的细菌岛上定植。图3B显示了上皮细胞与携带绿色荧光蛋白（GFP）的共生E. coli及携带红色荧光蛋白（RFP）的EHEC在细菌岛中的空间排布。当聚二甲基硅氧烷（PDMS）壁下降时，表达RFP的EHEC和表达GFP的共生细菌被限制在细菌岛内，表明可实现细菌岛与上皮细胞之间的有效隔离。
图1: 共培养模型中的细胞接种示意图。（1）降低PDMS壁以形成一个岛状区域，将共生细菌引入该岛状区域，并将纤连蛋白溶液流经岛状区域周围。（2）在岛状区域周围的区域接种HeLa细胞。（3）当HeLa细胞达到汇合状态且共生生物膜已形成后，将肠出血性大肠杆菌（EHEC）引入岛状区域。（4）升起PDMS壁，使岛状区域周围的HeLa细胞暴露于EHEC。插图为阀门操作细节示意图。
图 2：上皮细胞与细菌共培养的微流控模型。（A）共培养装置的三维示意图，显示由气动驱动的捕获区域，用于在上皮细胞中形成细菌微岛。每个细菌微岛（直径 1200 μm，间距 1000 μm）均设有独立的进样口和出样口，用于供给培养基并清除微岛废物。（B）共培养装置的显微图像，使用彩色染料显示不同区域（上皮细胞区、细菌微岛）。（C）通过气动激活通道（蓝色）降低 PDMS 壁（左图），将紫色染料引入封闭的微岛，并在周围持续流加黄色染料 48 小时，以展示气动捕获系统的可靠性。当 PDMS 壁被抬升（右图）后，微岛区域暴露于周围的黄色染料中。比例尺为 500 μm。
图3: HeLa细胞与细菌的共培养.（A）表达RFP的EHEC与表达GFP的 E. coli BW25113 在岛状结构中。（B）装置中透射光、绿色和红色荧光图像的叠加。比例尺代表 200 μm.
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讨论
传统的病原体黏附与定植检测方法利用组织培养板中的真核细胞单层，将病原体加入其中进行实验。这些模型缺乏生理相关性，因为它们未包含在真核细胞表面形成的共生细菌生物膜。简单地将预先培养的细菌接种到真核细胞上，几乎不可能形成这种结构，因为生物膜是随时间逐步发育形成的高度有序结构，而在细菌共存条件下长期培养真核细胞极其困难，几乎不可能实现而不造成细胞活力显著下降。由于在这些模型中，病原体无需穿越共生生物膜即可附着于上皮细胞，因此这些模型无法准确模拟胃肠道中上皮细胞与共生菌群的组织结构。本文中，我们介绍了一种微流控装置的构建方法，该装置利用气动控制的捕获机制实现真核细胞与细菌的共培养。以HeLa细胞作为模型真核细胞系，肠出血性大肠杆菌（EHEC）作为模型病原体，我们证明该共培养装置能够保持“岛状”区域的隔离，同时支持HeLa细胞单层以及共生E. coli生物膜的培养与发育。该微流控共培养模型不仅能够实现共生细菌与上皮细胞的空间定位，还能在病原体接触上皮细胞之前使其预先暴露于共生菌群；从而在定植过程中提供更接近生理状态的环境。此外，该共培养模型还可作为研究特定信号对EHEC感染性影响的基础研究工具，也可用于潜在益生菌株筛选等应用。
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致谢
本工作部分由美国国家科学基金会（CBET 0846453）和美国国立卫生研究院（1R01GM089999）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| SU-8 2050 | MicroChem Corp. | ||
| 高分辨率（16,256 dpi）光刻掩模 | Fineline-Imaging Inc, CO | ||
| 三氯(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三氟辛基)硅烷 | Sigma-Aldrich | 77279 | |
| PDMS | 道康宁公司（Dow Corning） | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| DMEM | 赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific, Inc.） | SH30002.02 | |
| 可编程旋涂仪 | Laurell Tech Corp | WS0650S | |
| 掩模对准器 | Neurotronix | Q4000 | |
| 氧气等离子体刻蚀机 | March Plasma System, CA | CS-1701 | |
| 注射泵 | Harvard Apparatus | ||
| 活/死细胞活力/细胞毒性检测试剂盒 | Invitrogen | L-3224 |
参考文献
- McDonald, J. C. Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing. Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).
- Jeon, N. L. Design and fabrication of integrated passive valves and pumps for flexible polymer 3-dimensional microfluidic systems. Biomed Microdevices. 4, 117-121 (2002).
- Baek, J. Y., Park, J. Y., Ju, J. I., Lee, T. S., Lee, S. H. A pneumatically controllable flexible and polymeric microfluidic valve fabricated via in situ development. J Micromech Microeng. 15, 1015-1020 (2005).
- Grover, W. H., Ivester, R. H., Jensen, E. C., Mathies, R. A., A, R. Development and multiplexed control of latching pneumatic valves using microfluidic logical structures. Lab Chip. 6, 623-631 (2006).
- Lee, J., Jayaraman, A., Wood, T. K., K, T. Indole is an inter-species biofilm signal mediated by SdiA. BMC Microbiol. 7, 42-42 (2007).
- Hsu, C. H., Folch, A. Microfluidic devices with tunable topographies. Appl Phys Lett. 86, 023508-023508 (2005).
- Hui, E. E., Bhatia, S. N. Micromechanical control of cell-cell interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5722-5726 (2007).
- Lee, J. Y. Integrating sensing hydrogel microstructures into micropatterned hepatocellular cocultures. Langmuir. 25, 3880-3886 (2009).
- Kim, J., Hegde, M., Jayaraman, A. Co-culture of epithelial cells and bacteria for investigating host-pathogen interactions. Lab-on-Chip. , (2009).
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