用于研究可溶性信号介导相互作用的上皮细胞与细菌微流控共培养

摘要

本方案描述了一种用于上皮细胞与细菌同时且局部共培养的微流控共培养模型。该模型可用于研究不同可溶性分子信号在发病机制中的作用，以及筛选潜在益生菌菌株的有效性。

摘要

人体胃肠道（GI）道是一个独特的环境，其中肠上皮细胞与非致病性（共生）细菌共存。有研究提出，病原体在共生菌层中所接触的微环境对其定植程度具有重要影响。目前用于研究病原体定植的培养方法并不适用于验证这一假说，因为它们无法以模拟胃肠道微环境的方式实现细菌与上皮细胞的共培养。本文描述了一种微流控共培养模型，该模型可实现真核细胞与细菌的独立培养，并可用于检测共生微环境对病原体定植的影响。该共培养模型通过构建一个共生菌Escherichia coliHeLa 细胞间的生物膜，随后引入肠出血性大肠杆菌E. coli（EHEC）定植到共生菌岛中，这一序列模拟了胃肠道感染中的事件顺序。

方案

1. 使用标准SU-8光刻技术制备硅模板¹ (本视频中未展示).

1. 在洁净室中，采用标准的 SU-8 光刻工艺制备 SU-8 “母模”（SU-8 2050，MicroChem，Newton，MA），用于制造不同部件（不同厚度的 PDMS 膜、共培养室）。此类母模可在任意微加工设施中制备（例如，斯坦福微流控工坊；http://thebigone.stanford.edu/foundry/）。
2. 在进行 PDMS 复型前，将 SU-8 母模置于连接真空源的干燥器中，暴露于氟硅烷蒸气，以促进 PDMS 从母模上顺利脱模。将一滴氟硅烷滴加至纸巾上，并抽真空 1 分钟。随后释放真空，静置 30 分钟以完成氟硅烷沉积。将 SU-8 母模保存于密闭容器中以备后续使用。

2. 以SU-8模具为模板的PDMS复制模塑²

1. 流体层和控制层通过在SU-8模具上复制成型PDMS制备。
2. 按10:1（重量比）混合PDMS预聚物与交联剂，并在真空干燥器中脱气1小时（或直至PDMS混合物中的气泡完全去除）。
3. 将SU-8模具置于培养皿中，小心地将PDMS混合物倾倒于其....

讨论

传统的病原体黏附与定植检测方法利用组织培养板中的真核细胞单层，将病原体加入其中进行实验。这些模型缺乏生理相关性，因为它们未包含在真核细胞表面形成的共生细菌生物膜。简单地将预先培养的细菌接种到真核细胞上，几乎不可能形成这种结构，因为生物膜是随时间逐步发育形成的高度有序结构，而在细菌共存条件下长期培养真核细胞极其困难，几乎不可能实现而不造成细胞活力显著下降。由于在这些模型中，病原体无需穿越共生生物膜即可附着于上皮细胞，因此这些模型无法准确模拟胃肠道中上皮细胞与共生菌群的组织结构。本文中，我们介绍了一种微流控装置的构建方法，该装置利用气动控制的捕获机制实现真核细胞与细菌的共培养。以HeLa细胞作为模型真核细胞系，肠出血性大肠杆菌（EHEC）作为模型病原体，我们证明该共培养装置能够保持“岛状”区域的隔离，同时支持HeLa细胞单层以及共生E. coli生物膜的培养与发育。该微流控共培养模型不仅能够实现共生细菌与上皮细胞的空间定位，还能在病原体接触上皮细胞之前使其预先暴露于共生菌群；从而在定植过程中提供更接近生理状态的环境。此外，该共培养模型还可作为研究特定信号对EHEC感染性影响的基础研究工具，也可用于潜在益生菌株筛选等应用。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SU-8 2050	MicroChem Corp.
高分辨率（16,256 dpi）光刻掩模	Fineline-Imaging Inc, CO
三氯(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三氟辛基)硅烷	Sigma-Aldrich	77279
PDMS	道康宁公司（Dow Corning）	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
DMEM	赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific, Inc.）	SH30002.02
可编程旋涂仪	Laurell Tech Corp	WS0650S
掩模对准器	Neurotronix	Q4000
氧气等离子体刻蚀机	March Plasma System, CA	CS-1701
注射泵	Harvard Apparatus
活/死细胞活力/细胞毒性检测试剂盒	Invitrogen	L-3224