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christopher hughes：血管生成研究的体外模型（访谈）

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher C.W. Hughes 描述了其培养系统在体外研究血管生成中的应用价值。他解释了成纤维细胞的重要性，这些细胞分泌一种关键但尚未明确的可溶性因子，能够促使内皮细胞在培养中形成具有分支、正常管腔并能进行吻合的血管结构。

Christopher C.W. Hughes 描述了其培养系统在体外研究血管生成中的应用价值。他解释了成纤维细胞的重要性，这些细胞分泌一种关键但尚未明确的可溶性因子，能够使内皮细胞在培养中形成具有分支、正常管腔并能进行吻合的血管结构。

Christopher Hughes：血管生成研究的体外模型（访谈）

Christopher C.W. Hughes 描述了其培养系统在体外研究血管生成中的应用价值。他解释了成纤维细胞的重要性，这些细胞……

您好，我叫Dr.Christopher Hughes。我是加州大学欧文分校的教授，我的实验室致力于研究血管生成。我们尤其关注调控血管生成过程的基因。我们基于Nelson的研究优化了一种体外实验方法，在该实验中可以观察血管生成过程中发生的所有不同步骤：我们将内皮细胞包被在Tedex微珠（即微小珠粒）上，然后将这些微珠嵌入纤维蛋白凝胶中，并添加生长因子。在数天内，内皮细胞从微珠上出芽，迁移、排列、增殖，形成管状结构，产生分支并建立吻合。因此，大约在第10天时，我们在体外培养中即可获得一个完整的类似毛细血管的网络结构。然而，体内和血管生成实验存在一些问题，例如在小鼠中进行的实验，其难点在于对系统的操控非常困难。当过程发生在动物体内时，很难进行可视化观察，你实际上无法看到血管生成的发生过程。而如果我们采用体外培养系统，则可以非常方便地对内皮细胞进行遗传学操作，开启或关闭特定基因，并研究这些操作对出芽型血管生成的影响。而在整个动物体内实现这一点要困难得多。你必须进行基因敲除或基因敲入。因此，这两者是主要优势。它易于操作，也易于观察。因此多年来，人们开发出了多种不同的体外血管生成检测方法，每种方法都有其各自的优缺点。其中一种广为人知的方法是基质凝胶检测法，即将内皮细胞接种在一种名为Matrigel的细胞外基质上。而问题在于，内皮细胞会形成类似管状的结构，但始终无法形成真正具有管腔的血管。你不会观察到出芽现象，也看不到吻合结构。也有胶原凝胶模型，这些模型可能效果较好。在这些情况下，你不会看到内皮细胞的增殖，也通常不会观察到吻合现象。我们所开发的纤维蛋白凝胶实验，是基于 Nelson Kar 在二十世纪九十年代中期发表的一个模型。现在我们已对此进行了显著改进，能够观察到血管生成的所有阶段。我们可以看到最初的出芽、细胞迁移，观察到细胞增殖、管腔形成，出现分支，最终实现吻合，在体外形成完整的血管网络。因此，我们认为该检测方法确实是目前可用于观察血管生成各个不同阶段的最佳体外体系。这种体外检测的另一个优势在于，我们可以进行激光显微切割。通过离心收集培养物使其变得非常扁平，然后使用激光显微切割显微镜，能够精确分离单个细胞，而我们尤其关注的是顶端细胞。因此，我们将这些区域切割出来，观察基因表达，特别是顶端细胞与主干细胞之间的差异，即实际形成管腔的细胞。我们的假设是，这两群细胞之间存在差异性基因表达。我们可以对此进行分析，而在体内系统中几乎不可能实现这一目标。因此，我们认为这是采用该体外实验方法的另一个主要优势。正如我之前提到的，Nelson Recon 在早期研究中使用了微血管内皮细胞。目前普遍认为，微血管内皮细胞是此类实验的理想选择，因为在体内正是微血管内皮细胞负责形成新的血管。我们决定尝试使用血管内皮细胞来完成这项工作。这些是人脐静脉内皮细胞，选择它们出于几个原因，其中之一是这些细胞很容易获得。你可以前往医院，从分娩室获取脐带，然后非常容易地分离出这些细胞。此外，这些细胞已在培养中使用了多年，其特性已被充分表征。因此，我们建立了该检测方法并对其进行了优化，以便能够出于上述原因使用这些细胞。有趣的是，结果表明，这些大血管内皮细胞在培养过程中似乎会转变为微血管内皮细胞的形态。它们失去了许多通常由大血管内皮细胞表达的基因，并开始表达通常与微血管内皮细胞相关的基因。它们完全能够形成类似毛细血管的出芽结构，产生管腔，并在培养中形成看起来与真正的毛细血管无异的结构。因此，它们使用简便，易于操作，且能实现我们期望的功能：出芽并形成具有正常管腔结构的血管。当我们需要对该实验进行定量分析时，实际上有几种方法可供选择。我们可以考察一些定量指标，例如出芽数量、芽的长度、芽的直径、分支点数量、吻合点数量等，同时也可以考察定性指标。例如，我们可以观察它们是否形成了管腔？而这可能正是我们最感兴趣的部分。在我们进行的许多检测中，都会关注其是否形成正确的管腔结构。这实际上更多是一种定性评估，尽管随着血管变大，人们也可以测量这些管腔的直径。因此，在这些培养物中我们使用成纤维细胞。将微珠嵌入纤维蛋白凝胶中，然后在凝胶表面接种成纤维细胞。成纤维细胞对于正常的出芽和管腔形成至关重要。在没有成纤维细胞的情况下，我们会观察到一些出芽现象。然而，内皮细胞往往无法保持彼此之间的连接。结果是，它们会相互迁移分离。因此，你在这种芽状结构上所构建的任何结构都容易瓦解。几天后，内皮细胞会发生凋亡。这表明成纤维细胞至少在此体外系统中产生了对血管生成至关重要的因子。我们一直非常关注这些因子究竟是什么。我们发现，成纤维细胞会向培养基中分泌某种物质，因此我们可以采用成纤维细胞的条件培养基，该培养基能够支持正常的出芽和管腔形成。由此可见，我们所面对的确实是一种可溶性因子。因此，我们显然非常希望了解成纤维细胞在此系统中生成了何种对血管生成至关重要的物质。我们已尝试了所有常见的候选因子，如VEGF、碱性fgF，这些因子在培养体系中存在，但额外添加并不能替代成纤维细胞的作用。我们还尝试了血管生成素-1、TGF-β、HGF等因子，但均未达到相同效果。到目前为止，我们尚未找到这一关键因子。因此，我们目前正在从成纤维细胞的条件培养基中纯化各种因子。我们将条件培养基依次通过多种层析柱，包括阳离子交换柱和凝胶过滤柱，从而获得具有活性的组分。 目前我们正在追踪这种活性，并收集这些组分，筛选出具有活性的部分。随后，我们可以将这些活性组分进行凝胶电泳，确保凝胶上的条带数量相对较少，然后切下这些条带，通过质谱进行测序分析。这一过程为我们带来了许多富有成果的研究进展。目前我们已获得多个候选基因，正在对它们逐一进行验证，以确认它们是否就是我们正在寻找的关键因子。因此，我们测试了多种已知的促血管生成因子，发现VEG GF和碱性FGF对于该实验中正常的出芽过程实际上是必需的。但这些并非全部因素。还有一些衍生因子也非常重要，正如我之前提到的。我们研究这一问题的方法之一是采用在体内具有高度血管生成能力的肿瘤细胞，这些细胞在小鼠体内能形成体积较大的肿瘤，并且具有高度的血管化特征。我们观察了这些肿瘤细胞，发现它们表达非常高水平的vegf，并已将这些细胞加入到我们的培养体系中。因此，在该实验中，我们用这些肿瘤细胞替代了成纤维细胞，但它们无法支持强烈的血管生成。这一点非常有趣。这表明——其他研究人员也提出了类似观点——肿瘤与基质（即组织中的成纤维细胞及其他支持细胞）以及内皮细胞之间存在相互作用。肿瘤细胞很可能产生某些直接作用于内皮细胞的因子，同时还会分泌另一些因子，刺激成纤维细胞及其他基质细胞产生促进血管生成的因子，从而共同支持强烈的血管生成过程。

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克里斯托弗休斯:在体外血管生成的研究模型（面试）

University of California, Irvine (UCI).  连续斯托弗休斯描述自己的文化系统的效用，研究在体外培养的血管生成。他解释说，成纤维细胞分泌的关键，但身份不明，可溶性因子，使血管内皮细胞，形成文化的船只，分公司，形成正确的流明，并接受anastamosis的重要性。

Summary

Christopher C.W. Hughes 描述了其培养系统在体外研究血管生成中的应用价值。他解释了成纤维细胞的重要性，这些细胞分泌一种关键但尚未明确的可溶性因子，能够促使内皮细胞在培养中形成具有分支、正常管腔并能进行吻合的血管结构。

Christopher Hughes：血管生成研究的体外模型（访谈）

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