利用血凝试验测定血清的反应性与滴度

摘要

血凝反应是一种抗体与红细胞结合的凝集现象。红细胞易于获取，且结果可用肉眼直接观察。本视频演示了血凝反应实验的操作步骤、结果判读以及效价的确定方法。

摘要

血凝集是凝集反应的一种特定形式，当抗体与作为颗粒性抗原的红细胞结合时发生。红细胞是特别有用的靶标，因其易于获取，且凝集现象可通过肉眼直接观察。该技术常用于测定抗体（Ab）效价、血型分型以及病毒定量。本视频将演示使用特异性识别A血型抗原的抗体对红细胞（Revercells）进行血凝集试验的操作步骤。将抗血清在96孔U型底微量滴定板中进行系列稀释，随后加入Revercells悬浮液。样品混合后于37°C孵育60分钟。孵育结束后，可直接肉眼判读各样品的阴性（-）、阳性（+）及中间型（-/+）血凝集反应。该方法利用快速简便的技术评估血清样本的反应性及抗体效价。视频内容将涵盖该试验的原理、结果的读取与解释、效价的确定方法、试验的可调整方案以及使用该技术时可能遇到的问题。 血凝集, 抗体效价, 血型分型, 病毒定量, 红细胞, 微量滴定, 37°C孵育, 凝集反应, 抗血清, 系列稀释

方案

5倍维罗纳尔缓冲盐水（VBS）的制备

1. 制备巴比妥缓冲盐水（VBS）时，需先配制三种不同的溶液。
2. 通过将21.25 g NaCl和0.94 g戊巴比妥钠溶解于350 ml蒸馏水中来配制溶液1。NaCl和戊巴比妥钠的终浓度分别为1.02 M和13 mM。
3. 通过将1.44 g巴比妥溶解于125 ml热蒸馏水中来配制溶液2。巴比妥的终浓度为62.5 mM。
4. 通过将20.33 g MgCl₂和4.41 g CaCl₂溶解于100 ml蒸馏水中来配制溶液3。MgCl₂和CaCl₂的终浓度分别为2.18 M和440 mM。
5. 将溶液1和溶液2混合，并冷却至室温。
6. 待混合溶液冷却后，加入1.25 ml溶液3，并用1 M HCl将pH调节至7.3–7.5。
7. 用蒸馏水定容至500 ml，得到5倍浓度的储备液。
8. 配制1倍工作液时，将储备液按1:5比例用蒸馏水稀释。

Revercells 的稀释

1. 轻轻颠倒重悬Revercells储存液，取1 ml细胞悬液，于4°C、600g离心5分钟。
2. 离心后，小心弃去上清液，将细胞重悬于3 ml 1×Veronal缓冲盐溶液中。
3. 细胞现可于4°C保存，直至使用。

步骤

1. 将50ml的1×VBS加入至96孔U型底板的A1-A12列中。
2. 向A1孔中加入50μl抗A血清，并使用移液器充分混匀。
3. 使用新的移液器吸头，从A1孔中取出50μl液体并转移至A2孔。充分混匀后重复此操作，依次转移至A11孔，最后将A11孔中的50μl液体弃去。
4. 血清样本现已完成连续2倍稀释，稀释比例从1:2至1:2048。A12孔不加血清，作为VBS阴性对照。
5. 若需检测多个血清样本，则对B行等重复步骤4.1–4.4。
6. 完成所有稀释后，向所有孔中加入50μl 1% Revercells。注意：Revercells在静置过程中会沉降，使用前应轻轻重悬。
7. 通过轻敲微量滴定板侧面混匀样本，覆盖后于37°C孵育1小时以进行血凝反应。可使用培养箱或温度受控的房间完成孵育。
8. 孵育结束后，小心将板从培养箱中取出，观察各孔的血凝情况。应首先检查VBS对照孔。若该孔为阴性反应，则结果有效；若VBS样本出现阳性血凝结果，则结果无效，需重复实验。阳性血凝反应表现为孔底形成一层广泛的细胞膜状沉淀，阴性反应则表现为孔底中心形成一个小而集中的细胞沉淀。中间型结果表现为外周有一圈阳性细胞的晕环，中心为沉淀的细胞核心；此结果提示血清中含有一定量可反应的抗体，但抗体浓度不足以引发完全反应。
9. 代表性结果部分提供了预期结果的两种图示。示例中分别展示了一组无效和有效结果，并将确定抗血清的滴度。

代表性结果：

视频中包含代表性结果的示例。以下（图1和图2）以示意图形式展示两个示例：第一个示例为无法判读的反应，因为VBS对照呈阳性；第二个示例为有效的检测，可据此确定滴度。

图1. 血凝试验中阳性结果失败的一个示例。在上述图示中，该血凝反应结果不可接受。VBS血清阴性对照显示出阳性血凝反应，表现为孔底出现片状沉淀。这表明实验过程中出现了错误，结果无效。在此情况下，应重新进行实验。

图2. 一个血凝试验的示例，其中阳性结果正确出现。在图示表示中，血凝反应有效。VBS阴性对照显示出阴性血凝反应，表现为孔底部形成的沉淀物。最后一个阳性孔为第7行，表明该血清样本的滴度为128（即1/128的倒数）。这代表血清中存在中等含量的抗体。

讨论

血凝试验是一种非常简单的技术，可在短时间内检测大量血清样本。该技术的另一个优点是无需特殊设备即可读取结果，肉眼观察即可。此技术还可经修改用于检测尿液中的人绒毛膜促性腺激素，作为血凝抑制试验的一部分。与标准血凝试验相关，在正确实施该检测时有几个需要特别注意的方面。首先，该技术依赖于细胞在凹面表面的沉降，因此必须使用U型或圆底微量滴定板。常用的平底板（如ELISA所用）不适用，因为阴性和阳性反应在平底板上表现相同。此外，应认识到当使用不同血清样本时，反应性抗体的浓度可能各不相同。在高抗体浓度下，抗原（Revercells）可能成为限制因素，从而出现前带效应。然而，这不会影响滴度值的判定，因为滴度被定义为最后一次观察到阳性反应的孔。最后，该技术并非定量方法，无法得知血清中反应性抗体的绝对水平。但在大多数情况下，这并非必需，特别是当仅需了解对已知抗原的反应性时。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Revercells	CSL	02490201	终浓度使用1%
Anti-A 血清	CSL	02611305
96孔U型底板	TRP	92097	必须为U型底
巴比妥缓冲盐水			终浓度使用1×
37°C 培养箱/室
一次性手套