本视频演示了一种从E13大鼠背侧脊髓分离并培养联合神经元的方法。离体培养的联合神经元可用于研究轴突生长与导向的细胞和分子机制。
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本文内容
摘要
摘要
连合神经元已被广泛用于研究胚胎脊髓发育过程中轴突导向的潜在机制。这些神经元的胞体位于脊髓背侧，其轴突在胚胎发育过程中沿高度保守的路径生长。连合轴突最初向腹侧投射，朝向底板；在穿越中线后，这些轴突转向头侧，并向脑部方向延伸。上述每一个步骤均由多种导向信号分子进行调控。高度富集连合神经元的培养体系非常适用于多种探究轴突路径寻找机制的实验，包括转向实验、免疫化学染色以及生物化学分析。在此，我们描述了一种从E13大鼠脊髓背侧分离并培养连合神经元的方法。首先，取出脊髓并解剖出背侧条状组织；随后通过胰酶消化和机械性分离将背侧组织解离为单细胞悬液。神经元被接种于多聚-L-赖氨酸包被的玻璃盖玻片或组织培养皿上。30小时后in vitro，大多数神经元已长出轴突。培养物的纯度（Yam等2009），通常超过90%，可通过使用连合神经元标志物DCC、LH2和TAG1进行免疫标记来评估（Helms和Johnson，1998）。该神经元制备方法是研究in vitro脊髓发育过程中连合性轴突生长与导向的细胞与分子机制研究。
方案
1. 胚胎大鼠背侧脊髓的解剖
一般建议
将L-15培养基置于冰上，并频繁更换解剖皿中的培养基以保持胚胎低温，这有助于维持组织完整性。除非另有说明，所有操作均使用两把Dumont #5镊子进行。为避免污染，需用70%乙醇喷洒所有工具和工作表面，并保持解剖用培养基瓶盖紧闭。在不同培养皿之间转移胚胎时，可使用剪去尖端的塑料移液管或带孔勺子。解剖过程中至关重要的是避免损伤脊髓（如划伤或拉伸），以确保解剖成功。
准备
- 冷的 L-15 培养基
- 50 mL L-15 加 10% 热灭活马血清（HiHS），置于冰上保存。
脊髓解剖
- 根据机构指南，使用 CO2 室对妊娠 13 天的大鼠（E0 = 交配后第一天）实施安乐死。
- 用 70% 乙醇喷洒腹部。用镊子夹起并提起下腹部区域的皮肤，用手术剪剪开。重复操作，切开肌肉层和腹膜层，进入腹腔。沿腹部两侧向上至胸部剪开组织，形成 V 形切口。提起并拉开组织，暴露腹腔。
- 子宫在三个位置与身体相连：下腹部中央以及两侧上角。通过夹住胚胎囊之间的组织提起子宫，剪断结缔组织以取出子宫，并将其放入盛有冰上 L-15 培养基的培养皿中。
- 后续步骤在解剖显微镜下进行。为将胚胎与胚外组织及胚膜分离，用一对镊子夹住子宫囊之间的组织，用另一对镊子夹住囊较透明的一侧，切开表层膜（颜色较深的一侧为胎盘）。轻轻挤压胎盘侧，将胚胎挤出。取出所有胚胎，并置于盛有冰上 L-15 培养基的培养皿中。
- 将一个胚胎放入盛有冰冻 L-15 培养基的 10 cm 培养皿中。使用显微剪，按图 1a 所示角度切除头部和后部组织。
以这些角度切割有助于将胚胎以“腹面朝下”的方式定位。 - 将胚胎以“腹面朝下”方式放置（前端远离操作者，后端朝向操作者）（图 1b）。
- 用镊子从一侧牢固夹住胚胎，以“压住”胚胎（图 1c）。不要移动镊子，以免撕裂组织。用另一对镊子从“固定”镊子之间的区域开始，剥离覆盖胚胎背部的皮肤（图 1d-e）。这将暴露脊髓，此时脊髓仍被膜包裹（即脑膜）。
应从脊髓两侧夹取皮肤，避免损伤脊髓。 - 将脊髓右侧的组织部分分离（图 1f）。从固定镊子所在水平开始，用闭合的镊子尽可能靠近脊髓处刺入组织，然后缓慢张开镊子以撕裂组织。此操作应使背根神经节（DRGs）与脊髓分离，同时破坏腹侧器官。在前端和后端保留部分组织。保留部分组织可增加胚胎重量，防止在下一步操作中被向上拉起。此外，该组织可用于后续步骤中夹持胚胎。
- 从前端开始，使用钩状钨针切开脑膜，并沿顶板纵向打开脊髓（图 1g）。
- 将胚胎旋转 180 度（后端远离操作者，前端朝向操作者）（图 1h）。
此操作可使实验人员用同一只手分离胚胎另一侧的组织。 - 通过夹住先前已分离的一侧来固定胚胎，并用相同方法处理剩余一侧的组织（见步骤 1.8）。完成后，完全分离脊髓两侧的组织。
替代方法：完全分离左侧剩余组织，但在右侧的前端和后端保留部分组织。此方法有时有助于在步骤 1.12 中保持脊髓位置稳定。 - 将脊髓侧放，去除大部分残留的间充质组织和背根神经节（DRGs）（图 1i）。
- 在此阶段，脑膜和脊髓是彼此贴合的两层“片状”组织。用镊子压住脊髓最前端较大的部分，从脊髓上剥离一小段脑膜（图 1j，左）。然后，用镊子横跨夹住两个分离的片段，以平稳、连续的动作剥离脑膜（图 1j）。
不均匀的“剥离”会导致脊髓和/或脑膜层断裂。通常无法回收仍附着于脑膜的脊髓部分。 - 使用塑料移液管将分离的脊髓转移至含有 L-15 + 10% HiHS 的培养皿中，并置于冰上。通常在解剖背侧部分之前，先收集所有胚胎的脊髓。
背侧脊髓解剖
- 将一根脊髓置于含有 L-15+10% HiHS 的培养皿中，使其呈“开放书本”状平放。切除较宽的前部组织（包含部分后脑）（图 1k）。
- 背侧组织位于脊髓最外侧部分（图 1l，左）。用直的钨针固定脊髓的同时，使用L形钨针切下一条宽度约为半侧脊髓五分之一的组织条（图 1l，右）。将背侧组织条放入含有 L-15 + 10% HiHS 的 15 mL 塑料离心管中，并置于冰上。
约 12 个 E13 胚胎的背侧神经管组织在解离后可用于铺板的细胞数约为 350–400 万个。若对背侧脊髓进行粗略解剖（切取更宽的背侧条带），可获得更多的细胞，但联合神经元的纯度会降低。
2. 联合神经元培养
一般建议
除非另有说明，所有步骤均应在生物安全柜中的无菌条件下进行。使用新鲜培养基以及 freshly-thawed 的补充剂和试剂。解离和吹打步骤在无 Ca2+/Mg2+ 的 HBSS 中进行，以尽量减少依赖 Ca2+/Mg2+ 的细胞黏附。
准备
- 包被的盖玻片（使用德国Desag玻璃）或组织培养板（参见下文包被步骤）。
- 预热的Neurobasal铺板培养基（见下文），置于组织培养皿中并置于CO₂培养箱中2 在接种前，于组织培养孵育箱中平衡至少1.5小时。
- 2.5% 胰蛋白酶在 37 °C 水浴锅
- 2 瓶 HBSS Ca2+/毫克2+-自由，一次一个 4 °C，一个在 37 °C.
- 两支经火焰抛光的玻璃巴斯德吸管：一支直径为常规尺寸的一半，另一支直径略小于常规尺寸的一半。使用已灭菌的巴斯德吸管。进行火焰抛光时，使用本生灯（外层淡蓝色火焰顶端）将吸管尖端加热熔化，使其直径略微缩小。由于此步骤在组织培养超净台外进行，操作完成后需用70%乙醇喷洒吸管，再移入组织培养超净台内。为更高效地回收神经元，在解离开始前或吹打前，用含血清的培养基预润巴斯德吸管（将培养基吸入管内，静置30秒）。此举可防止吹打过程中细胞黏附在巴斯德吸管内壁。
- 用于洗涤PLL包被培养皿或盖玻片的无菌milliQ水
- 12.5% MgSO₄4 HBSS 中的溶液
多聚赖氨酸包被
若使用玻璃盖玻片，铺板前需用酸清洗24小时并进行灭菌处理（参见Kaech和Banker，2006）。使用德国Desag玻璃盖玻片。
在玻璃盖玻片或塑料组织培养皿上包被多聚-L-赖氨酸的方法：
- 在组织培养罩内，用100 µg/mL多聚赖氨酸（PLL）溶液形成的液滴覆盖表面，作用1.75–2小时。
- 用MilliQ水清洗两次，每次至少5分钟（可在下方细胞解离步骤期间进行）。
- 清洗后保存于水中直至使用。切勿让PLL包被的表面干燥。
为减少PLL在盖玻片包被过程中的浪费，可将盖玻片置于无菌的细菌培养皿中。通过在盖玻片上形成液体液滴进行包被和清洗。由于细菌培养皿具有疏水性，液体将保留在玻璃盖玻片上。在接种细胞前，再将盖玻片转移至组织培养皿中。
若神经元接种于塑料组织培养皿上，通常细胞贴附性更高，可能导致神经突的伸长受到抑制。
解离与接种
- 确认背侧条带已沉降至管底。用巴氏吸管吸除大部分 L-15+10% HiHS。迅速加入 3 ml 冷（4 °C）HBSS 洗涤背侧神经管条带一次。
- 让背侧神经管条带静置沉降 2 分钟，然后用巴氏吸管吸除 HBSS。
- 加入温热（37 °C）HBSS 至终体积 4.7 ml。然后加入 0.3 ml 2.5% 胰蛋白酶，使终浓度为 0.15% 胰蛋白酶。
- 在 37 °C 水浴中孵育 7 分钟。孵育中途轻柔混匀一次。
- 加入 30 μl DNA酶（25 000 U/mL），使终浓度为 150 U/mL。加入 60 μl MgSO4 并短暂混匀，使终浓度为 0.15%。
对于粗分离所得组织，需在 37 °C 水浴中额外孵育 1 分钟。
此时，背侧神经管组织应已出现碎片化。若背侧神经管未开始碎裂，通常表明 2.5% 胰蛋白酶储备液已失效，应解冻新批次；或冷 HBSS 洗涤未能有效去除样品中的 HiHS。 - 以 200 g 离心 4 分钟，沉淀组织碎片。
- 用巴氏吸管吸除上清液，管底保留约 50–100 μl 液体。
- 轻弹管壁使沉淀松散，然后加入 5 ml 温热 HBSS 洗涤细胞。室温静置 2 分钟。
- 以 200 g 离心 5 分钟。
- 用巴氏吸管吸除上清液，管底保留约 50–100 μl 液体。
- 轻弹管壁使沉淀松散并部分重悬细胞，然后加入 2 ml 温热 HBSS。
- 使用小口径（半径减半）火焰抛光玻璃巴氏吸管，缓慢吹打细胞 4–6 次以解离细胞。避免产生气泡，吹打时液体应沿管壁流动。切勿过度吹打。
- 使用最小口径的火焰抛光玻璃巴氏吸管，进一步缓慢吹打 3–4 次以解离细胞。避免产生气泡，吹打时液体应沿管壁流动。切勿过度吹打。
对于 粗分离 所得组织，在解离结束时向管中额外加入 1 ml 温热 HBSS。
解离细胞时，无需将所有细胞团块和聚集体完全解离。若继续吹打不再减少细胞聚集体的尺寸，应停止吹打，或更换为更小口径的巴氏吸管。 - 让残留的组织碎片在管中静置沉降 1 分钟。无需将细胞转移至新管。
- 取 20 μl 细胞悬液，加入 5 μl 台盼蓝，用血细胞计数板计数细胞。
通过台盼蓝排斥法检测，神经元存活率应 ≥95%。 - 将神经元接种于 Neurobasal 接种培养基中（见下文 配方）。
- 为获得单个分散神经元（低密度培养，避免细胞聚集或重叠）建议的接种密度：
- 6 孔板：每孔 120 000 – 180 000 个细胞
- 12 孔板：每孔 60 000 – 75 000 个细胞
- 16–18 小时后，更换为 Neurobasal 生长培养基（见下文 配方）
换液时切勿使用真空泵从培养皿中抽吸培养基，应轻柔使用移液器。以避免神经元脱落。
代表性结果：
铺板后4小时，神经元应已黏附至多聚-L-赖氨酸（PLL）包被的表面。在相差显微镜下，已黏附的细胞胞体通常呈相对扁平且为椭圆形（图2a）。未充分黏附的细胞则呈现为球形，当培养皿侧面被轻轻敲击时，这些细胞会轻微移动。多种因素均可能影响细胞的黏附（参见讨论部分）。
30 小时后 体外大多数神经元已长出带有可见生长锥的轴突（图2c,d）。若观察到轴突生长不良，需确认神经基础生长培养基是否使用新鲜培养基和补充剂配制。在这些条件下，神经元至少可保持健康状态6天。该方法已被证实可稳定获得富含联合神经元的培养物，其中约90%的神经元表达DCC（Yam et al. 2009）。用于制备细胞悬液的脊髓背侧条带宽度会影响培养物的纯度，使用较薄的条带可获得更高的纯度。图3（免疫荧光）展示了一个应用示例。更多示例请参见Yam等（2009）的文章。
图 1. 脊髓解剖步骤示意图。D = 背侧，V = 腹侧。点击此处查看大图。
图 2. 接种在PLL包被的玻璃盖玻片上的分离连合神经元的代表性结果。a,b) 接种后4小时，神经元已黏附于表面。标尺 = 20 μm。c,d) 接种后30小时，大多数神经元已延伸出轴突，并可见明显的生长锥。标尺 = 20 μm。
图3. 一条联合神经元经免疫染色显示γ-微管蛋白（绿色），F-肌动蛋白用鬼笔环肽标记（F-actin，红色），细胞核用DAPI标记（蓝色）。
配方与说明
神经基础铺板培养基
- Neurobasal
- 10% 热灭活胎牛血清（HiFBS）
- 2 mM L-谷氨酰胺（来自 200 mM 储存液）
可选：青霉素/链霉素抗生素（使用正常浓度的一半）
Neurobasal 生长培养基
- Neurobasal
- B27（从原液按1/50稀释）
- 2 mM L-谷氨酰胺（来自200 mM原液）
- 可选：青霉素/链霉素抗生素（使用正常浓度的一半）
培养基配制完成后，可在4 °C保存两周。在接种细胞前，将培养基置于组织培养用培养皿中，并放入组织培养孵育箱中至少1.5小时，以平衡培养基的温度和pH。
Neurobasal
神经基础培养基（Neurobasal medium）开瓶后，可在 4 °C 避光保存一个月。若开瓶超过一个月，请弃置不用，否则细胞存活率将降低。
热灭活胎牛血清（HiFBS）或热灭活马血清（HiHS）
将FBS或HS在56 °C水浴中加热30分钟以进行热灭活。每隔约10分钟轻轻摇动瓶子一次。（为确保准确性，可使用一个装有水的相似大小的瓶子，将温度计插入水瓶中以监测温度，当达到56 °C时开始计时。）热灭活后的FBS可能需要离心以去除沉淀物，并可在-20 °C分装后重新冷冻保存。
L-谷氨酰胺
每次实验均应使用新解冻的L-谷氨酰胺分装样品。
B27
B27 的等分试样可于 -20 °C 长期保存，或于 4 °C 保存不超过一个月。
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讨论
我们描述了一种从胚胎大鼠脊髓中分离和培养联合神经元的方法。该方法已在本实验室常规使用，可稳定地制备神经元，用于研究轴突导向的细胞与分子机制。对于细胞生物学和免疫化学实验，一窝胚胎所提供的神经元数量已足够。当需要更多细胞时（例如在许多生物化学实验中），则可能需要分离两窝胚胎。对于经过训练的操作人员，可在4小时以内完成约20个胚胎的解剖与离解。若操作时间延长，由于组织完整性的改变，脊髓的解剖将变得更加困难，并可能影响活神经元的有效回收。
首次进行该操作时，可将细胞接种在多种聚赖氨酸（PLL）包被的表面（如酸洗玻璃盖玻片、组织培养皿）上进行比较。通常情况下，细胞应能牢固地贴附于PLL包被的塑料组织培养皿或多孔板上。若细胞在玻璃盖玻片上的贴附和生长出现问题，可利用此方法作为细胞活力和培养状态的一般性检查。导致细胞在玻璃表面贴附不良的主要因素是玻璃材质及盖玻片的清洁质量（酸洗和灭菌处理），这会通过降低PLL包被效率在一定程度上影响细胞贴附。其他常见因素包括PLL包被效果不佳（包被时间过短或PLL溶液过期）、细菌或真菌污染，以及使用了过期或变质的培养基或添加剂。
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致谢
本研究得到了加拿大卫生研究院（CIHR）、彼得·劳吉德医学研究基金会、麦吉尔大学神经工程计划、魁北克健康研究基金会（FRSQ）以及加拿大创新基金会（CFI）的资助。Sébastien D. Langlois 获得了魁北克健康研究基金会（FRSQ）的硕士培训奖以及加拿大卫生研究院（CIHR）的弗雷德里克·班廷和查尔斯·贝斯特加拿大研究生奖学金（硕士级别）的支持。我们感谢 Jessica M.T. Pham 在图表制作方面提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Neurobasal 培养基，液体 | Invitrogen | 21103-049 | 参见配方与注意事项 |
| B27添加剂 50X | Invitrogen | 17504 | 参见配方与注意事项 |
| 0.01% 聚-L-赖氨酸溶液 | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| L-15 培养基，粉末 | Invitrogen | 41300-070 | |
| 胰蛋白酶 2.5%（10倍浓缩） | Invitrogen | 15090-046 | |
| DNAse I，25000 U/mL | 沃辛顿生物化学 | ||
| MgSO₄4 | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| HBSS，Ca2+/毫克2+无- | Invitrogen | 14170-112 | |
| L-谷氨酰胺 200 mM，液体 | Invitrogen | 25030-081 | 参见配方与注意事项 |
胚胎大鼠背侧脊髓的解剖（另见表 I）
联合神经元培养（另见表 I）
|
参考文献
- Charron, F., Stein, E., Jeong, J., McMahon, A. P., Tessier-Lavigne, M. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. , 113-1111 (2003).
- Fabre, P., Shimogori, T., Charron, F. Segregation of ipsilateral retinal ganglion cell axons at the optic chiasm requires the Shh Receptor Boc. Journal of Neuroscience. 30, 266-275 (2010).
- Helms, A. W., Johnson, J. E. Progenitors of dorsal commissural interneurons are defined by MATH1 expression. Development. 125, 919-928 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1, 2406-2415 (2006).
- Okada, A., Charron, F., Morin, S., Shin, D. S., Wong, K., Fabre, P. J., Tessier-Lavigne, M., McConnell, S. K. Boc is a receptor for sonic hedgehog in the guidance of commissural axons. Nature. 444, 369-373 (2006).
- Yam, P. T., Langlois, S. D., Morin, S., Charron, F. Sonic hedgehog guides axons through a noncanonical, Src-family-kinase-dependent signaling pathway. Neuron. 62, 349-362 (2009).
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