本视频演示了一种从E13大鼠背侧脊髓分离并培养联合神经元的方法。离体培养的联合神经元可用于研究轴突生长与导向的细胞和分子机制。
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本文内容
摘要
摘要
连合神经元已被广泛用于研究胚胎脊髓发育过程中轴突导向的潜在机制。这些神经元的胞体位于脊髓背侧，其轴突在胚胎发育过程中沿高度保守的路径生长。连合轴突最初向腹侧投射，朝向底板；在穿越中线后，这些轴突转向头侧，并向脑部方向延伸。上述每一个步骤均由多种导向信号分子进行调控。高度富集连合神经元的培养体系非常适用于多种探究轴突路径寻找机制的实验，包括转向实验、免疫化学染色以及生物化学分析。在此，我们描述了一种从E13大鼠脊髓背侧分离并培养连合神经元的方法。首先，取出脊髓并解剖出背侧条状组织；随后通过胰酶消化和机械性分离将背侧组织解离为单细胞悬液。神经元被接种于多聚-L-赖氨酸包被的玻璃盖玻片或组织培养皿上。30小时后in vitro，大多数神经元已长出轴突。培养物的纯度（Yam等2009），通常超过90%，可通过使用连合神经元标志物DCC、LH2和TAG1进行免疫标记来评估（Helms和Johnson，1998）。该神经元制备方法是研究in vitro脊髓发育过程中连合性轴突生长与导向的细胞与分子机制研究。
方案
1. 胚胎大鼠背侧脊髓的解剖
一般建议
将L-15培养基置于冰上，并频繁更换解剖皿中的培养基以保持胚胎低温，这有助于维持组织完整性。除非另有说明，所有操作均使用两把Dumont #5镊子进行。为避免污染，需用70%乙醇喷洒所有工具和工作表面，并保持解剖用培养基瓶盖紧闭。在不同培养皿之间转移胚胎时，可使用剪去尖端的塑料移液管或带孔勺子。解剖过程中至关重要的是避免损伤脊髓（如划伤或拉伸），以确保解剖成功。
准备
- 冷的 L-15 培养基
- 50 mL L-15 加 10% 热灭活马血清（HiHS），置于冰上保存。
脊髓解剖
- 根据机构指南，使用 CO2 室对妊娠 13 天的大鼠（E0 = 交配后第一天）实施安乐死。
- 用 70% 乙醇喷洒腹部。用镊子夹起并提起下腹部区域的皮肤，用手术剪剪开。重复操作，切开肌肉层和腹膜层，进入腹腔。沿腹部两侧向上至胸部剪开组织，形成 V 形切口。提起并拉开组织，暴露腹腔。
- 子宫在三个位置与身体相连：下腹部中央以及两侧上角。通过夹住胚胎囊之间的组织提起子宫，剪断结缔组织以取出子宫，并将其放入盛有冰上 L-15 培养基的培养皿中。
- 后续....
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讨论
我们描述了一种从胚胎大鼠脊髓中分离和培养联合神经元的方法。该方法已在本实验室常规使用，可稳定地制备神经元，用于研究轴突导向的细胞与分子机制。对于细胞生物学和免疫化学实验，一窝胚胎所提供的神经元数量已足够。当需要更多细胞时（例如在许多生物化学实验中），则可能需要分离两窝胚胎。对于经过训练的操作人员，可在4小时以内完成约20个胚胎的解剖与离解。若操作时间延长，由于组织完整性的改变，脊髓的解剖将变得更加困难，并可能影响活神经元的有效回收。
首次进行该操作时，可将细胞接种在多种聚赖氨酸（PLL）包被的表面（如酸洗玻璃盖玻片、组织培养皿）上进行比较。通常情况下，细胞应能牢固地贴附于PLL包被的塑料组织培养皿或多孔板上。若细胞在玻璃盖玻片上的贴附和生长出现问题，可利用此方法作为细胞活力和培养状态的一般性检查。导致细胞在玻璃表面贴附不良的主要因素是玻璃材质及盖玻片的清洁质量（酸洗和灭菌处理），这会通过降低PLL包被效率在一定程度上影响细胞贴附。其他常见因素包括PLL包被效果不佳（包被时间过短或PLL溶液过期）、细菌或真菌污染，以及使用了过期或变质的培养基或添加剂。
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致谢
本研究得到了加拿大卫生研究院（CIHR）、彼得·劳吉德医学研究基金会、麦吉尔大学神经工程计划、魁北克健康研究基金会（FRSQ）以及加拿大创新基金会（CFI）的资助。Sébastien D. Langlois 获得了魁北克健康研究基金会（FRSQ）的硕士培训奖以及加拿大卫生研究院（CIHR）的弗雷德里克·班廷和查尔斯·贝斯特加拿大研究生奖学金（硕士级别）的支持。我们感谢 Jessica M.T. Pham 在图表制作方面提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Neurobasal 培养基，液体 | Invitrogen | 21103-049 | 参见配方与注意事项 |
| B27添加剂 50X | Invitrogen | 17504 | 参见配方与注意事项 |
| 0.01% 聚-L-赖氨酸溶液 | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| L-15 培养基，粉末 | Invitrogen | 41300-070 | |
| 胰蛋白酶 2.5%（10倍浓缩） | Invitrogen | 15090-046 | |
| DNAse I，25000 U/mL | 沃辛顿生物化学 | ||
| MgSO₄4 | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| HBSS，Ca2+/毫克2+无- | Invitrogen | 14170-112 | |
| L-谷氨酰胺 200 mM，液体 | Invitrogen | 25030-081 | 参见配方与注意事项 |
胚胎大鼠背侧脊髓的解剖（另见表 I）
联合神经元培养（另见表 I）
|
参考文献
- Charron, F., Stein, E., Jeong, J., McMahon, A. P., Tessier-Lavigne, M. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. , 113-1111 (2003).
- Fabre, P., Shimogori, T., Charron, F.
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