Lashley III 迷宫是一种不依赖厌恶刺激或视觉线索的路径学习任务。因此，它是评估学习和记忆能力的理想选择，尤其适用于老年小鼠或其他需要考虑应激因素的情况。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
许多用于评估啮齿类动物（尤其是小鼠）学习和记忆能力的行为学实验，依赖视觉线索、食物和/或饮水剥夺，或其他厌恶刺激来促使动物完成任务。随着动物年龄增长，其感觉功能会逐渐衰退。例如，许多品系的小鼠会出现听力缺陷或白内障。在任务学习过程中，指导小鼠行为所依赖的感觉系统发生变化，这可能在解释老年动物学习能力变化时引入混杂因素。此外，当比较对压力敏感性不同的小鼠时，使用厌恶刺激来激励动物学习任务本身也可能带来混杂效应。为了尽量减少此类混杂影响，我们采用了一种改良版的拉什利III型迷宫（Lashley III maze）。该迷宫依赖于路径学习，即小鼠在低应激条件下（例如黑暗期、无需食物/饮水剥夺）通过反复训练，逐步学会从起始位置到达一个模拟巢穴箱，且在连续两次试验中仅出现0次或1次错误。我们将此归类为低应激行为学测试，因为它不依赖厌恶刺激来促进动物对迷宫的探索和任务的学习。实验装置由一个模块化起始箱、一个四臂迷宫主体和一个目标箱组成。在目标箱末端设有一个模拟巢穴箱，其中装有与动物日常饲养笼具中相似的垫料，并在整个迷宫测试期间专属于同一只动物。已有研究证实，这种模拟巢穴箱能够提供足够的奖励，以激励小鼠学会导航迷宫。1. 本文展示了Lashley III迷宫实验的操作过程，旨在评估小鼠在学习与记忆方面与年龄相关的变化，并比较两种不同遗传背景品系小鼠的学习行为。我们希望，其他致力于研究小鼠衰老或应激易感性影响的研究人员，能够将该迷宫视为一种有吸引力的替代方案，以取代那些涉及更高应激性学习任务和/或视觉线索的行为学检测方法。
方案
1. 准备：
- 拉什利III型迷宫由有机玻璃（Plexiglas）制成，如图1所示。起始箱、迷宫臂和目标箱采用模块化设计，便于清洁并可对迷宫进行调整。起始箱、迷宫臂和目标箱的壁由黑色有机玻璃制成，以消除迷宫内外的视觉线索。迷宫臂长45 cm，高7 cm，宽5 cm。通往相邻迷宫臂的门为4 cm × 4 cm，位于迷宫外壁11 cm处。目标箱尺寸为19.5 cm长 × 7 cm高 × 5 cm宽。起始箱尺寸为8 cm × 9.5 cm × 7 cm。在起始箱、迷宫和目标箱顶部放置单独的透明有机玻璃盖片，以便观察小鼠在迷宫中行进的过程，同时防止小鼠逃逸。迷宫放置在一个由红色有机玻璃制成的底座上，底座足够大，可容纳迷宫的三个部分以及一个伪居住房笼，该伪居住房笼与动物标准居住房笼尺寸相同。
- 在首次迷宫实验前准备伪居住房笼时，将与动物居住房笼中相同类型的新鲜垫料添加到侧壁开有门洞（2 cm × 2 cm）的独立笼底中。将金属网盖安装在这些笼底上，并为每个测试队列中的每只动物单独编号。这些笼子将在整个测试期间作为每只动物的个体化伪居住房笼使用。由于我们正在研究应激和/或焦虑相关行为在学习与记忆中的作用，因此使用伪居住房笼以避免将小鼠单独饲养在各自的居住房笼中。然而，如果这些因素并非主要关注点，则可将动物单独饲养在侧壁开有门洞的标准居住房笼中，这些经改造的居住房笼可作为成功完成迷宫任务后的居住房笼。
2. 测试：
- 每天，动物需在测试开始前至少一小时被转移至行为测试室，以使其适应测试环境。
- 测试开始前30分钟，从所有饲养笼中移除食物和水。将食物和水保留在行为测试室内，但确保小鼠无法触及。通常在光照期转为黑暗期后30分钟（即进食高峰过后）移除食物和水。这可确保动物在测试前基本达到食物和水的饱足状态；然而，在此期间进行测试可为小鼠穿越迷宫提供轻微的额外动机，尽管任务完成后并无明显的食物或水奖励。
- 30分钟的测试前准备期结束后，使用70%乙醇清洁迷宫。保持起始箱通往迷宫臂的门关闭，目标箱两端的门则保持开启。
- 将对应于第一只动物的模拟家笼放置在目标箱末端。
- 用手掌托起第一只小鼠，将其带至迷宫处，放入起始箱，并盖上盖子。
- 当观察者处于无遮挡观察迷宫的位置后，打开起始箱门，并立即启动三个秒表。
- 当小鼠的四只脚均离开起始箱时，关闭起始箱门，并停止第一个计时器。
- 手动记录小鼠在穿越迷宫过程中的行进路径。当小鼠的四只脚全部进入某一新区域或迷宫臂时，视为进入该区域（见图1）。
- 当小鼠的四只脚全部进入目标箱时，关闭迷宫与目标箱之间的门，并停止第二个秒表。
- 当小鼠完全进入模拟家笼后，关闭目标箱与家笼之间的门，停止第三个秒表。
- 记录三个秒表的时间。统计小鼠出现的错误次数。错误定义为进入死胡同盲端区域（例如从臂L进入区域K；图1），或回溯已通过的迷宫臂（例如从臂F返回臂C；图1）。虽然我们通常在实验过程中实时评分小鼠表现，但也可通过录像或其他方式记录迷宫试验，以便后续人工或使用自动化软件进行评分。实验者应根据实际情况选择合适的方法。
- 将动物留在模拟家笼中1分钟后，再将其放回其原始饲养笼。
- 对测试队列中的所有小鼠重复步骤2.3至2.12。
- 当队列中的最后一只小鼠被放回其饲养笼后，启动30分钟计时器。此30分钟结束后，为队列中所有小鼠重新提供食物和水，然后将动物送回饲养室。
- 在连续数个夜晚重复该程序，每只动物每天进行一次试验，直至队列中所有小鼠达到预设的学习标准，或完成预定数量的测试试验。当一只小鼠在连续两次试验中均能以0次或1次错误完成任务时，即判定其已学会该迷宫。在后续试验中，小鼠的测试顺序保持不变。
3. 代表性结果：
学会所需天数（达到标准）可在特定研究的不同组间进行分析和比较（图2A和图3A）。此外，还可计算学习指数（学习比率），以表征迷宫习得情况，该指数基于测试期前四天的数据进行评估（图2B和图3B）。学习指数定义为每次试验中正确行进的路径段数量与总行进路径段数量的比值。在第1次试验中，小鼠首次接触迷宫，其行为主要依赖随机探索，此时平均学习指数应约为0.5。随着试验推进，在第2至第4次试验期间，学习指数逐渐上升并趋近于1，表明学习过程正在发生。在图2中，年轻（2月龄）与老龄（24月龄）雄性C57Bl/6NCr小鼠接受Lashley迷宫训练，最多进行15次试验。年轻小鼠学会迷宫所需时间为7.2（±1.5）d，而老龄小鼠达到标准所需时间为11.7（±2.1）d。老龄C57Bl/6NCr小鼠学会迷宫所需时间更长的趋势非常显著（[t(23)=1.59, P=0.056；单侧检验 t-测试， 先验的 假设老年小鼠学会所需天数更长）。计算学习指数时，两个年龄组在第2至第4次试验中均表现出学习指数的稳步上升（时间的主效应显著） P<0.001）。然而，年轻C57小鼠与年老C57小鼠之间的学习指数差异无统计学意义（年龄的主效应 P=0.58).
图3代表了研究背景品系对学习行为影响的典型实验。图2中显示的年轻雄性C57Bl/6NCr小鼠的数据现与年轻Crl:CD-1(ICR)BR小鼠[CD-1，4-5月龄]的数据进行比较。CD-1小鼠学会Lashley III迷宫所需时间为4.5（±1.4）天；然而，两个品系在学会任务所需的天数上无显著差异（图3A；[t(18)=1.328，P=0.20]；双尾t检验）。相比之下，对学习指数的分析显示，尽管所有动物在首次试验中均是随机探索迷宫，但CD-1小鼠学习任务的速度更快（品系主效应，P<0.001）。这体现在CD-1小鼠在第2至第4次试验中学习指数的上升幅度显著高于C57Bl/6NCr小鼠。有趣的是，如果在达到学习标准后继续对CD-1小鼠进行迷宫训练，它们会表现出过度训练的行为特征（图4），这一点将在下文进一步讨论。
图1：Lashley III 型迷宫。 为便于说明，本示意图中将迷宫的死胡同盲区标为红色。实际迷宫的底部和臂部为实色（插图）。迷宫按比例绘制（尺寸见正文）。
图 2：2 月龄和 24 月龄雄性 C57Bl/6NCr 小鼠在 Lashley III 迷宫中的表现。 采用 Lashley III 迷宫评估年轻（2 月龄）和衰老（24 月龄）雄性 C57Bl/6NCr 小鼠的路径学习能力。测量的参数包括 (a) 达标所需天数，即小鼠连续两个晚上跑完迷宫且错误次数为 0 次或 1 次所需的天数；以及 (b) 学习指数，即在 Lashley III 迷宫测试第 1 至第 4 天期间，正确四肢进入臂的次数与总进入臂次数的比值。每组动物数量为：2 月龄小鼠 n=10，24 月龄小鼠 n=15。
图 3：年轻雄性 C57Bl/6NCr 与 CD-1 小鼠在 Lashley III 迷宫中的表现。 采用 Lashley III 迷宫评估 2 月龄 C57Bl/6NCr 小鼠与 4–5 月龄 CD-1 小鼠的路径学习能力。所测量的参数包括 (a) 达到标准所需天数，即小鼠连续两晚在迷宫中跑动时每晚错误次数不超过 1 次所需的天数；以及 (b) 学习指数，即在 Lashley III 迷宫测试第 1 至第 4 天期间，正确四爪进入臂的次数与总进入臂次数的比值。每组动物数量为：C57Bl/6NCr 小鼠 n=10，CD-1 小鼠 n=10。统计学显著性：*P<0.05，**P<0.01，与 C57Bl/6NCr 小鼠相比。
图 4：4-5 月龄雄性 CD-1 小鼠在 Lashley III 迷宫中的表现。 采用 Lashley III 迷宫评估十只 4-5 月龄雄性 CD-1 小鼠连续 15 天的路径学习能力。测量的参数包括 (a) 每天发生的错误次数，错误定义为四肢完全进入死胡同盲端区域，或进入迷宫中已走过的臂段；以及 (b) 每天在迷宫中的停留时间。达到判定标准的天数以红色箭头标示。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
评估学习和记忆功能最常用的大鼠行为学实验是莫里斯水迷宫以及恐惧条件反射的多种变体2。这些实验依赖视觉或听觉线索进行学习，并使用厌恶刺激（例如水环境、足底电击）来促使动物完成任务3。在老年啮齿类动物中，与人类衰老过程类似，各种感觉功能会随时间逐渐衰退。某些背景品系的小鼠在衰老过程中会丧失听力或出现白内障，且研究表明，随着年龄增长，小鼠在23.5小时脱水后的死亡率显著升高4。因此，在老年啮齿类动物中，这些常用行为学测试结果的变化可能难以准确解释。
Lashley III 迷宫最初由 Karl Lashley 于 1929 年描述5。Lashley 使用这一范式，结合皮层损毁技术，试图在大脑皮层中寻找记忆的痕迹。我们对该迷宫进行了轻微修改，以提高其在老年啮齿类动物研究中的广泛适用性。我们取消了以食物为线索的迷宫导航方式，并证明伪家园笼环境足以激励年轻和老年小鼠完成迷宫任务1。其他研究者也曾使用食物颗粒作为奖励，以促进 Lashley III 迷宫的学习7。...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
所有行为学实验方案均经宾夕法尼亚州立大学机构动物照护与使用委员会批准。无任何财务披露事项需要报告。
致谢
本实验所用的Lashley III迷宫由宾夕法尼亚州立大学物理系机械加工车间的Tim Bowmaster、Paul Corman、Barry Dutrow、Ryan Jabco和Tim Treaster建造。作者谨此感谢Shoba Belegundu女士、Tara Chrzanowski女士和Alexandra Lewis女士在完成图2-4所示实验过程中提供的协助。Walter Jackson先生在本实验方案的准备过程中提供了宝贵的反馈意见。本研究由美国国家心理健康研究所（资助号：MH064756和MH077978，授予AMA）提供资金支持。本内容完全由作者负责，不代表美国国家心理健康研究所或美国国立卫生研究院的官方观点。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 拉什利三型迷宫 | PSU 物理机械加工车间 | 不适用 | 迷宫需定制，无商业产品 |
参考文献
- Blizard, D. A. Return to home cage' as a reward for maze learning in young and old genetically heterogeneous mice. Comparative Med. 56, 196-201 (2006).
- Crawley, J. N. What's wrong with my mouse?: Behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice. , 2nd ed, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken. (2007).
- Blizard, D. A., Klein, L. C., Cohen, R., McClearn, G. E. A novel mouse-friendly cognitive task suitable for use in aging studies. Behav. Genet. 33, 181-189 (2003).
- Warren, J. Appetitive learning by old mice. Exp. Aging Res. 12, 99-105 (1986).
- Lashley, K. Brain mechanisms and intelligence: A quantitative study of injuries to the brain. , University of Chicago Press. Chicago. (1929).
- Barnes, C. Memory deficits associated with senescence: A neurophysiological and behavioral study in the rat. J. Comp. Physiol. Psych. 93, 74-104 (1979).
- Matzel, L. D. Individual differences in the expression of a general learning ability in mice. J. Neurosci. 23, 6423-6433 (2003).
- Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. The use of the Morris water maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci. 48, 29-69 (1989).
- Hepler, D. J., Wenk, G. L., Cribbs, B. L., Olton, D. S., Coyle, J. T. Memory impairments following basal forebrain lesions. Brain Res. 346, 8-14 (1985).
- Sci, B. ehavB. rain 2, 313-313 (1979).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
