利用 Styryl 染料光转化研究突触囊泡池

摘要

FM染料在理解突触动态方面提供了不可估量的帮助。通常在不同刺激条件下，通过荧光显微镜观察FM染料的信号。然而，将FM染料的光转化技术与电子显微镜相结合，可实现对突触小体中不同突触囊泡池以及其他超微结构组分的可视化观察。

摘要

突触小泡与质膜的融合（胞吐作用）是神经递质释放和神经元间通信所必需的步骤。随后，这些小泡从质膜上被回收（内吞作用），并重新归入神经末梢内的小泡总池中，直至它们再次经历新的胞吐与内吞循环（小泡循环）。这些过程已通过多种技术手段进行研究，包括电子显微镜、电生理记录、安培法和电容测量法。尤其在过去二十年中，一系列荧光标记物相继出现，使得光学技术能够用于追踪小泡在循环过程中的动态变化。其中最常用的标记物之一是苯乙烯基染料（即FM染料）¹；从结构上看，所有FM染料均包含一个亲水性头部和一个疏水性尾部，二者通过芳香环以及一个或多个双键相连（图1B）。一种经典的FM染料实验方法是在刺激神经（通过电刺激或高K⁺溶液）的同时，将样品（图1Ai）浸入含有染料的溶液中。该过程可诱导小泡循环，并使染料被新近内吞的小泡摄取（图1A_i-iii）。在小泡完成染料加载后，将其转移至无染料溶液中并进行第二次刺激，即可通过胞吐作用释放FM染料（图1A_iv-v），此过程可通过监测荧光强度的下降（脱色）来实时追踪。

尽管FM染料在囊泡循环研究领域发挥了重要作用，但使用常规荧光显微镜无法确定单个囊泡的精确定位或形态。因此，本文介绍如何通过光转化技术，将FM染料作为内吞标记物用于电子显微镜观察。光转化技术利用了荧光染料在强光照下产生活性氧物种的特性。将荧光标记的样品浸入含有二氨基联苯胺（DAB）的溶液中并进行光照。染料分子产生的活性物种会氧化DAB，形成稳定且不溶性的深色沉淀物，可在电子显微镜下清晰识别^2,3。由于DAB仅在荧光分子附近被氧化（因为活性氧物种寿命极短），该技术可确保只有荧光标记的结构才会含有电子致密沉淀。因此，该技术可用于研究活跃循环细胞器的精确位置和形态。

方案

1）黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）神经肌肉接头（NMJ）的制备

1. 制备标准果蝇生理盐水（130 mM NaCl, 36 mM 蔗糖, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 5 mM Hepes, pH 7.3 ⁴）。
2. 在生理盐水中进行标本解剖（1.1）。将果蝇幼虫背侧朝上固定于Sylgard培养皿中，沿纵轴切开背侧，去除内脏器官，然后将标本拉伸并固定。随后可使用多个腹侧肌肉进行实验。

2) 刺激与FM染色

1. 建议在弱光条件下进行以下所有步骤，以防止 FM 染料发生漂白。
2. 为化学刺激神经，使用高钾缓冲液。配制含有 90 mM KCl 和 10 μM FM1-43 染料的果蝇生理盐水（见 1.1）。将溶液避光保存。
3. 在室温下用预先配制的缓冲液孵育样本 1 分钟。
4. 用标准果蝇生理盐水（1.1）洗涤，以去除细胞外的 FM1-43 染料。随后迅速进行固定。

3) 固定

1. 将样品置于含2.5%戊二醛的磷酸盐缓冲液（PBS）中，在室温下固定45分钟。为良好保存形态学特征，优先选用戊二醛而非多聚甲醛。
2. 用PBS洗涤一次，然后将样品浸入100 mM NH₄Cl溶液中15分钟。此步骤旨在淬灭残留戊二醛固定剂中的游离醛基。
3. 用常规PBS洗去NH₄Cl溶液。

4) 光转化

1. 在含有 1.5 mg ml⁻¹ 二氨基联苯胺（DAB）的 PBS 中，将神经肌肉接头（NMJ）样本于 4°C 孵育 30 分钟。
2. 将样品置于荧光显微镜下，使用相对低倍的水浸物镜（20× 0.5 NA）寻找并聚焦荧光信号。
3. 以最大灯强度照射样品，直至FM染料完全漂白（图1C）。为确认光转化是否发生，建议在FM染料漂白步骤前后，使用透射光观察样品。若发生光转化，应可见深棕色沉淀物（图1C）。照射时间因光照强度及DAB渗透程度而异。对于大多数样品，使用20倍物镜时，约30–45分钟的照射时间最为适宜；使用更高倍率物镜（60倍）时，则采用较短的照射时间。
4. 我们更倾向于使用带有后置反射镜灯箱的汞灯进行照明，该反射镜可收集背向散射的光束，从而提高总光强。

5）样品的电镜处理

1. 四氧化锇处理
   1. 用一体积四氧化锇与三体积水配制溶液（每份样品约 300 μl）。操作四氧化锇时必须在通风橱内进行，并佩戴手套和眼部防护设备。
   2. 将样品在四氧化锇溶液中室温孵育 1 小时（在通风橱内）。
   3. 用 PBS 充分洗涤（4–5 次，每次 5 分钟），并将每份样品转移至洁净的玻璃烧瓶中。
2. 脱水
   1. 分别配制含 30%、50%、70%、90%、95% 和 100% 乙醇的溶液。
   2. 向每份样品中加入 1 ml 30% 乙醇，作用 5 分钟。
   3. 向每份样品中加入 1 ml 50% 乙醇，作用 5 分钟。
   4. 向每份样品中加入 1 ml 70% 乙醇，作用 5 分钟。
   5. 向每份样品中加入 1 ml 90% 乙醇，作用 5 分钟。
   6. 向每份样品中加入 1 ml 95% 乙醇，作用 5 分钟（重复 3 次）。
   7. 向每份样品中加入 1 ml 100% 乙醇，作用 5 分钟（重复 3 次）。
3. 包埋及后续处理
   1. 将一体积 Epon 树脂与一体积乙醇混合，加入样品中并在持续旋转条件下作用（2–4 小时）。
   2. 将样品置于开口烧瓶中的 100% Epon 树脂内，使残留乙醇完全挥发（4–6 小时）。
   3. 将样品置于模具中，在 60°C 下放置 36 小时。
   4. 电镜样品制备。采用标准超薄切片技术，将样品切成 50–80 nm 的薄片进行处理。
4. 电镜成像
   1. 采用常规电镜方法对样品进行成像。

6) 代表性结果

预期结果如图1C和图2所示。光照过程会导致形成棕色的DAB沉淀，该沉淀在荧光和透射成像中均可见。光照过程中首先出现的现象是FM染料染色相关的荧光消失。相比之下，由醛类固定剂引起的背景荧光在整个实验过程中均可见。荧光淬灭通常在光照开始后约10-20分钟内发生。在此时间点通常无法观察到光转化产物。

应持续照射，约10分钟后，由于DAB的积累，样品将变为棕色（图1C_iv）。目前尚不清楚DAB沉淀与FM染料漂白为何不能同时发生；可能的原因是氧化型DAB需要积累到一定量后才能发生聚集和沉淀，因此该反应比漂白过程更慢。然而在此阶段，样品尚不能用于电镜制样，因为DAB沉淀可能尚未完成。我们倾向于再等待5至10分钟，直至样品（即突触前神经末梢）呈现深棕色或黑色，表明DAB已完全转化。此时可观察到样品整体表面出现轻微着色（例如神经肌肉接头中的肌纤维），这很可能与自发荧光（和/或固定剂荧光）诱导的DAB转化有关，但不会对实验造成不利影响。

然后将样品进行透射电子显微镜制备，并检查是否存在深色（标记的）囊泡。正如我们先前所证实的^5,6，这些囊泡比未标记的囊泡密度更高，因此易于区分（图2B）。为了提高区分不同类型囊泡的几率，不应对接面进行增强对比度的复染（不使用醋酸铀或柠檬酸铅染色）；锇染色足以观察大多数细胞结构，且其颜色不如DAB沉淀物深。

图1：FM染料及其在光转化中的应用。（A）表示使用FM染料在刺激条件下对囊泡进行负载和去染的经典实验步骤。（i）将样品孵育于含有FM染料的缓冲液中。（ii）通过电或化学方式刺激，诱导囊泡在FM染料存在下发生融合。（iii）刺激后继发的内吞作用会将仍存在于细胞外缓冲液中的FM染料摄入部分囊泡内。（iv）通过缓冲液洗涤去除细胞外的FM染料。（v）再次刺激可促使已负载染料的囊泡在胞吐过程中释放FM染料。（B）示意图显示FM1-43染料的头部、连接桥和尾部结构。（C）果蝇（Drosophila）神经肌肉接头（NMJ）光转化实验示例。（i）在用FM1-43对NMJ进行染料负载、洗去外部染料分子并固定后，可通过传统落射荧光显微镜（63倍物镜）观察神经末梢的荧光信号。（ii-iii）在持续照明下，染料完全漂白。（iv）当照明继续时，由于二氨基联苯胺沉淀而出现黑色沉淀。比例尺为10 μm。

图2：光转化样品的电镜示例。（A）图像显示一个含有突触小泡的神经末梢，但并非所有小泡均发生光转化；这可能是由于光照不足或二氨基联苯胺在组织中渗透不良所致。（B）多个突触小泡呈深色（被填充），表明其经历了FM光转化。（C）过度照射导致整个末梢变暗，无法分辨小泡或其他细胞器。比例尺为200 nm。

讨论

应考虑以下几个关键步骤：

• 必须在彻底清洗并淬灭样品后，才能进行DAB孵育。否则未反应的戊二醛会与DAB发生反应，导致其沉淀（通常表现为扁平晶体，无电子密度）。若样品中出现大量此类沉淀，则通常无法用于透射电子显微镜观察。
• 光照时间应通过测试多个相同样品在不同光照时间下的效果进行优化。根据我们的经验，最佳转化效果（图2B）出现在约5分钟的时间窗口内（例如，从光照开始后35至40分钟之间）。光照不足（图2A）表现为无标记细胞器或部分标记的细胞器（例如，囊泡仅在其体积的一半中显示含有DAB）。相反，过长的光照会导致过度转化——DAB转化产物大量积累，使细胞器结构扭曲，并扩散至胞质溶胶中（图2C）。此类样品在透射电镜下呈现为黑色结构，几乎无法观察到形态细节。

我们已在多种样本制备中应用了该技术，包括秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）、黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）、斑马鱼（Danio rerio）以及蛙类（Rana ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
FM 1-43	Invitrogen	F10317
环氧树脂 Epon	Plano GmbH	R1030
二氨基苯肼盐酸盐	Sigma-Aldrich	D5905
50% 戊二醛	AppliChem	A3166	电镜级
硅胶 Sylgard	Dow Corning	104186298
Axioskop 2 FS plus 显微镜	Carl Zeiss, Inc.
20倍物镜，数值孔径 0.5	Olympus Corporation		干式物镜
100 W 汞灯	Carl Zeiss, Inc.
带反光镜的灯箱	Carl Zeiss, Inc.	1007-980
MRm 相机	Carl Zeiss, Inc.	0445-554	图像采集
激发滤光片（HQ 470/40）	AHF	F49-671
二向色镜（495 DCLP）	AHF	F33-100
发射滤光片（HQ 500 LP）	AHF	F42-018
EM	Carl Zeiss, Inc.
Proscan CCD HSS	Proscan Electronic Sys.		1024 × 1024