本演示的目的是展示一种高度可重复的方法，用于在软骨缺损中生成可被磁共振成像（MR成像）可视化的基质相关干细胞植入物。干细胞使用美国食品药品监督管理局（FDA）批准的超顺磁性氧化铁颗粒Ferumoxides进行标记，与琼脂糖混合后植入软骨缺损区域，并使用7T磁共振扫描仪进行成像。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
组织工程领域融合了工程学、细胞生物学和医学的原理，旨在实现特定细胞和功能性组织的再生。基质相关干细胞植入物（MASI）旨在修复因关节炎或创伤性关节损伤导致的软骨缺损。成体间充质干细胞（MSCs）具有分化为软骨细胞谱系的能力，并在基于细胞的关节软骨修复技术中展现出良好的应用前景。自体MSCs可从多种组织中分离获得，能够在细胞培养中扩增而不丧失其分化潜能，并已在体外和体内实验证实具有软骨分化能力in vitro和in vivo1, 2。
为了在软骨缺损中实现移植间充质干细胞（MSCs）的局部滞留和存活，需要使用支架材料，该材料还需支持细胞后续的分化与增殖。支架的结构可引导组织形成，并允许干细胞产生的细胞外基质得以扩展。既往研究表明，2%琼脂糖支架可支持稳定透明软骨的发育，且不会引发免疫反应3。
在MASI中长期保留移植的干细胞对于软骨再生至关重要。利用氧化铁纳米颗粒标记MSCs，可实现通过无创性MR成像技术对细胞进行长期的体内示踪4。
本演示将介绍使用氧化铁纳米颗粒标记间充质干细胞（MSCs）、制备细胞-琼脂糖复合物以及将这些复合物植入软骨缺损部位的技术。标记后的复合物可通过磁共振成像（MR-Imaging）进行无创追踪。
方案
1. 使用 Endorem 标记 hMSCs
- 细胞在标记前至少培养18小时，直至达到80%汇合度。
- 在此期间，通过将Endorem以100 µg Fe/mL的剂量加入无血清培养基中，制备标记培养基。
- 细胞达到汇合后，吸除培养基，并用PBS或无血清培养基洗涤细胞1次。
- 随后吸除洗涤液，加入预先制备的标记培养基，将细胞置于37°C、5% CO2条件下孵育4小时。
- 孵育4小时后，吸除标记培养基，用PBS洗涤细胞，并按常规方法进行胰酶消化。
- 胰酶消化后，细胞用PBS洗涤3次，以400 ×g离心5分钟。
- 完成洗涤步骤后，将细胞重悬，计数并评估活力，根据实验需要使用。
2. 准备琼脂糖
- 细胞标记完成后，即可开始制备琼脂糖溶液。
- 使用精密天平称取80mg琼脂糖粉末，加入2ml PBS中。
- 将该溶液轻轻振荡混匀后进行高压灭菌。
- 约40分钟后，可从高压灭菌器中取出液态琼脂糖溶液。测量其体积，并用预热的PBS相应调整至所需体积。
- 随后将溶液冷却至42°C
3. 创建 MASI
- 当琼脂糖溶液达到所需温度后，对细胞进行计数，并在1.5 ml离心管中最后一次离心。
- 离心后弃去上清液，将细胞与DMEM混合，使细胞浓度达到30 × 106 个细胞/ml。
- 现在将细胞与42°C温热的琼脂糖混合。
- 使用冷的移液枪头可能导致琼脂糖在枪头内部凝固，因此建议通过反复吸取热的无菌PBS来预热枪头。
- 现在吸取与培养基等体积的琼脂糖，与细胞-培养基悬液充分混合，以形成均匀的悬液。
- 混合过程中将离心管置于预热的水浴中，以防止琼脂糖冷却至凝固。
- 当悬液均匀后，将细胞植入缺损部位。
图1. 髌骨标本冠状面T2加权自旋回波成像（TR 4000 ms/ TE 18.27 ms），显示软骨缺损处植入的hMSCs。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本方案提供了一种可重复的方法，用于用氧化铁纳米颗粒标记间充质干细胞（MSCs），并将标记后的MSCs植入软骨缺损区域。该技术可通过磁共振成像（MR成像）无创地显示软骨缺损部位的干细胞移植情况，从而实现对MASI治疗失败的早期检测。通过观察MR图像上移植部位标记信号的消失，可诊断标记细胞的移位或外流。早期诊断这些事件具有重要意义，可避免患者接受不必要的替代性有创诊断操作。所述的这种用于评估MASI治疗效果的无创方法，有助于推动基于细胞的骨关节炎软骨再生疗法的成功开发。目前，本方案正应用于临床前的体内研究，原则上具备临床应用潜力，未来可作为临床实践中评估MASI疗法效果的无创性结局评价指标。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
本工作获得了美国国立关节炎与肌肉骨骼皮肤疾病研究所（NIH RO1AR054458）的资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| D-MEM 高糖 | 试剂 | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| PBS（无 Ca++、Mg++） | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | ||
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA | Invitrogen | 25399-120 | ||
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | ||
| 青霉素/链霉素 | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | ||
| 超顺磁性氧化铁颗粒（Ferumoxides，商品名：Endorem） | Guerbet | |||
| 琼脂糖 VII 型 | Sigma-Aldrich | A9045 | 将琼脂糖用 PBS 稀释至终浓度为 4% |
参考文献
- Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture. Osteoarthritis Cartilage. 14, 179-189 (2006).
- Pittenger, M. F. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Rahfoth, B. Transplantation of allograft chondrocytes embedded in agarose gel into cartilage defects of rabbits. Osteoarthritis Cartilage. 6, 50-65 (1998).
- Henning, T. D., Boddington, S., Daldrup-Link, H. E. Labeling hESCs and hMSCs with iron oxide nanoparticles for non-invasive in vivo tracking with MR imaging. J Vis Exp. , (2008).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
