磁小体相关蛋白 MamAΔ41 的纯化：来自 M. magneticum 菌株 AMB-1

摘要

MamA 是一种独特的与磁小体相关的蛋白质，已被证明参与磁小体的活化过程。本文介绍了从M. magneticum AMB-1中纯化 MamA 缺失突变体（MamAΔ41）的实验方案。

摘要

趋磁细菌是一类多样化的水生微生物，能够沿着地磁场方向定向移动。这种行为被认为有助于它们寻找适宜的生存环境(1). 这种能力由磁小体赋予，磁小体是一种亚细胞器，由脂质囊泡线性链状排列组成，每个囊泡均能生物矿化并包裹一个约50 nm的磁铁矿或硫铁矿晶体。磁小体的一个关键组分是MamA，已被证明是功能性囊泡形成所必需的蛋白。MamA是一种丰度很高的磁小体相关蛋白，也是目前研究最为深入的磁小体相关蛋白之一。in vivo (2-6)。本文重点介绍 MamA 的纯化，尽管该蛋白已被研究in vivo，尚未发现其明确的功能或结构细节。生物信息学分析表明，MamA 是一种含有四次三十四肽重复序列（TPR）的蛋白质。TPR 是一种结构模体，广泛存在于多种蛋白质中，可单独存在或作为更大折叠结构的一部分，其作用是作为蛋白质-蛋白质相互作用的模板，并介导多蛋白复合物的形成。(7)TPR结构域参与真核细胞细胞器过程中的许多关键任务，以及多种细菌信号通路。(8-14)。为了研究含有独特TPR结构域的蛋白质MamA，首先需要获得高纯度的蛋白质。本文介绍了从稳定表达的MamA缺失突变体（MamAΔ41）中纯化该蛋白的实验方案。M. magneticum AMB-1.

方案

1. 克隆与表达 mamA 基因在 E. coli

突变基因 mamAΔ41 使用聚合酶链式反应（PCR）从基因组DNA中扩增 Magnetospirillum magneticum AMB-1, 引物序列：5'-GCATTACGCATATGGACGACATCCGCCAGGTG-3' 和 5'-GCGCGGCAGCCATA-TGGCATACG-3'。在扩增的DNA片段中，起始密码子ATG处引入了NcoI位点，终止密码子被替换为ScoI位点。将片段用NcoI和SacI消化后，连接至pET52b(+)载体的相应位点，构建得到pET52bMamAΔ41-AMB1。在此构建体中， mamAΔ41 基因在C末端与10-His标签进行了框内融合。将质粒电转化至大肠杆菌BL21菌株中。含有pET52b-MamAΔ41质粒的大肠杆菌BL21菌株在自动诱导培养基中培养 (15) 含氨苄青霉素（50 mg/ml）的培养基 310°K 3小时。随后将培养温度从 310° 到 300°K 并额外维持 48 小时 300°K通过在5465g离心10分钟收集细胞 277°K8升培养液获得60克湿菌体沉淀。

2. 生物信息学计算

根据氨基酸序列，使用 Pr....

讨论

蛋白质纯化是任何蛋白质生化或结构研究中的关键步骤。由于每种蛋白质都具有独特的性质和行为，因此需要明确其特性，并相应地调整纯化方案。应首先利用生物信息学工具对目标蛋白质进行分析，作为纯化的第一步。这些工具可用于计算目标蛋白的等电点，评估其对还原/氧化环境的需求，以及对特殊离子或配体的需求。我们的实验方案包含若干关键性调整，以反映目标蛋白的独特性，这些调整包括缓冲液的选择、工作温度以及层析柱条件的优化。

第一个关键的改进是所使用的缓冲液（第3.3节），需要调整这些缓冲液以反映蛋白质稳定性和功能所需的正确pH范围、离子/配体及离子强度。如果目标蛋白出现任何不稳定的迹象（如降解、沉淀或功能丧失），则需要测试并寻找其他更合适的缓冲液。另一个关键问题是纯化速度和操作温度。为了防止蛋白质降解（由蛋白酶或蛋白质自身不稳定引起），应快速进行纯化，并在277°K下操作（包括使用低温缓冲液、转子和层析柱）。

亲和纯化步骤以及其他层析步骤可以在多种树脂来源上进行。亲和树脂可通过多种技术加载蛋白质，具体方法应根据本地条件进行调整。若通过将蛋白质溶液.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
法国压滤器	仪器设备	赛默飞世尔科技公司	FA-078A
压力细胞	仪器设备	赛默飞世尔科技公司	FA-032
超速离心机	仪器设备	Sorvall，赛默飞世尔科技	Discovery 90SE
Rottor	仪器设备	贝克曼库尔特公司	Ti60
超速离心管；PC-瓶盖检测 26.3 ml	仪器设备	贝克曼库尔特公司	BC-355618
2.5 cm 直径，玻璃 Econo-Column 层析柱	仪器设备	Bio-Rad	737-2521
Ni-NTA His Bind 树脂	仪器设备	Novagen，EMD Millipore	M0063428
分光光度计	仪器设备	Amersham	Ultraspec 2100 pro
石英比色皿	仪器设备	赫尔马	104-QS
快速蛋白液相色谱 - AKTA purifier 10	仪器设备	GE Healthcare	28-4062-64
离子交换柱 – MonoQ 4.6/100 PE	仪器设备	GE Healthcare	10025543
尺寸排阻预装柱-HiLoad 26/60 Superdex 200	仪器设备	GE Healthcare	17-1071-01
Centricon - Vivaspin15 – 10,000 截留分子量	仪器设备	Sartorius AG	VS1501
台式离心机	仪器设备	赛默飞世尔科技公司	IEC CL30R
MALDI-TOF	仪器设备	布鲁克公司	Reflex IV
Tris-HCl（羟甲基）氨基甲烷	试剂	生物实验室	20092391
氯化钠	试剂	FRUTROM	235553470
咪唑	试剂	Alfa Aesar	288-32-4
无EDTA蛋白酶抑制剂混合物	试剂	Sigma-Aldrich	P-8849
脱氧核糖核酸酶 I (DNase I)	试剂	Sigma-Aldrich	DN-25
牛凝血酶	试剂	Fisher Scientific	BP25432
甘氨酸	试剂	生物实验室	07132391
十二烷基硫酸钠（SDS）	试剂	生物实验室	19822391
β-巯基乙醇–乙醇	试剂	Sigma-Aldrich	M-3148
InstantBlue	试剂	Expedeon	1SB01L
PageRuler 预染蛋白标记	试剂	Fermentas	SM0671