MamA 是一种独特的与磁小体相关的蛋白质，已被证明参与磁小体的活化过程。本文介绍了从M. magneticum AMB-1中纯化 MamA 缺失突变体（MamAΔ41）的实验方案。
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摘要
摘要
趋磁细菌是一类多样化的水生微生物，能够沿着地磁场方向定向移动。这种行为被认为有助于它们寻找适宜的生存环境(1). 这种能力由磁小体赋予，磁小体是一种亚细胞器，由脂质囊泡线性链状排列组成，每个囊泡均能生物矿化并包裹一个约50 nm的磁铁矿或硫铁矿晶体。磁小体的一个关键组分是MamA，已被证明是功能性囊泡形成所必需的蛋白。MamA是一种丰度很高的磁小体相关蛋白，也是目前研究最为深入的磁小体相关蛋白之一。in vivo (2-6)。本文重点介绍 MamA 的纯化，尽管该蛋白已被研究in vivo，尚未发现其明确的功能或结构细节。生物信息学分析表明，MamA 是一种含有四次三十四肽重复序列（TPR）的蛋白质。TPR 是一种结构模体，广泛存在于多种蛋白质中，可单独存在或作为更大折叠结构的一部分，其作用是作为蛋白质-蛋白质相互作用的模板，并介导多蛋白复合物的形成。(7)TPR结构域参与真核细胞细胞器过程中的许多关键任务，以及多种细菌信号通路。(8-14)。为了研究含有独特TPR结构域的蛋白质MamA，首先需要获得高纯度的蛋白质。本文介绍了从稳定表达的MamA缺失突变体（MamAΔ41）中纯化该蛋白的实验方案。M. magneticum AMB-1.
方案
1. 克隆与表达 mamA 基因在 E. coli
突变基因 mamAΔ41 使用聚合酶链式反应（PCR）从基因组DNA中扩增 Magnetospirillum magneticum AMB-1, 引物序列：5'-GCATTACGCATATGGACGACATCCGCCAGGTG-3' 和 5'-GCGCGGCAGCCATA-TGGCATACG-3'。在扩增的DNA片段中，起始密码子ATG处引入了NcoI位点，终止密码子被替换为ScoI位点。将片段用NcoI和SacI消化后，连接至pET52b(+)载体的相应位点，构建得到pET52bMamAΔ41-AMB1。在此构建体中， mamAΔ41 基因在C末端与10-His标签进行了框内融合。将质粒电转化至大肠杆菌BL21菌株中。含有pET52b-MamAΔ41质粒的大肠杆菌BL21菌株在自动诱导培养基中培养 (15) 含氨苄青霉素（50 mg/ml）的培养基 310°K 3小时。随后将培养温度从 310° 到 300°K 并额外维持 48 小时 300°K通过在5465g离心10分钟收集细胞 277°K8升培养液获得60克湿菌体沉淀。
2. 生物信息学计算
根据氨基酸序列，使用 ProtParam 服务器（http://www.expasy.ch/tools/protparam.html）计算分子量（MW）以及预测蛋白质在 280 nm 处的吸光度（1 mg/1 ml）。10His-Tag-MamAΔ41 的分子量为 22529 Da（240 个氨基酸），MamAΔ41（经凝血酶切除 His 标签后剩余 9 个氨基酸）的分子量为 20596.5 Da（187 个氨基酸）。10His-Tag-MamAΔ41 在 280 nm 处（1 mg/1 ml）的预测吸光度为 0.595，MamAΔ41 为 0.579。此外，该氨基酸序列不含任何半胱氨酸残基，因此纯化过程中无需添加还原剂。
3. 纯化 MamAΔ41
- 用于配制储备液，称量并分别配制以下浓度的溶液各 200 ml：咪唑（分子量 228.2 g/mol）4 M 溶液、NaCl（分子量 58.44 g/mol）5 M 溶液、Tris-HCl（分子量 121.3 g/mol）1 M 溶液，调节 pH 至 8.0。加入双蒸水（DDW），使用涡旋振荡器混匀直至溶液澄清。用滤膜过滤溶液 0.22μm 过滤后室温保存。
- 配制并过滤6种新鲜缓冲液（从储备溶液，见表1）。
- 将细胞用缓冲液A按1:2的比例稀释并重悬，即每克细胞加入2毫升缓冲液A。
- 添加 10μl 每10克细菌加入10毫升DNase I（1 mg/ml），以降解样品中的DNA片段。每20克细菌加入1毫升不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物。冰上孵育20分钟。
- 通过两轮 25,000 psi 的法式高压匀浆器破碎细胞。与超声处理不同，法式高压匀浆器适用于大体积样本>通过将细胞在高压下强制通过一个细小的孔口，实现10 ml细胞的挤出。由于使用过程中会产生热量，活塞在组装和使用前应在冰上冷却十分钟。
- 将裂解后的细胞转移至25 ml超速离心管中，用缓冲液A精确平衡（±50 mg），直至样品液面达到离心管的颈部刻度线。
- 通过超速离心在 270,000g 条件下离心 1 小时，分离细胞碎片 277°K.
- 制备自制重力镍柱（Ni-NTA柱，直径2.5 cm）：将4 ml保存在20%乙醇中的Ni-NTA树脂加入柱中，待液体完全滴尽后，用40 ml去离子水（DDW）洗涤，并让液体完全滴尽。随后用40 ml缓冲液A对柱中树脂进行预平衡。
- 将超速离心管中的可溶性组分上样至重力镍柱（Ni-NTA柱），让液体自然滴落，收集穿流液（未结合蛋白），并于277 K保存。
- 使用小枪头刮取超速离心管中的沉淀样品，将枪头混入 50μl 含5% β-巯基乙醇的2X SDS-PAGE上样缓冲液。
- 用100 ml缓冲液B洗涤层析柱。让液体滴出，收集流出液并于277 K保存。
- 准备15个已标记的离心管（1.5 ml）。
- 洗脱——关闭柱阀，然后将1 ml缓冲液C加样至柱上；孵育3分钟，随后打开柱阀并收集流出液。重复此步骤三次。
- 以1 ml缓冲液C的增量洗脱剩余悬浮液，并关闭阀门。
- 在280 nm处测定各组分的OD值，评估蛋白峰的位置；如果OD值仍然 >0.3，需要额外的样本。
- 收集组分的SDS-PAGE分析。还应对以下样品进行此类分析：未结合蛋白穿流组分、洗涤穿流组分以及超速离心沉淀样品。混合 10μl 从每个样本中 10μl 加入含5% β-巯基乙醇的2X SDS-PAGE上样缓冲液，将样品上样至15% SDS-PAGE凝胶，在180伏电压下电泳运行45分钟。
- 将凝胶置于15 ml InstantBlue溶液中染色，摇动1小时。确保塑料盒加盖并避光。
- 评估凝胶；若蛋白表达量高且条带特异性明显，则合并选定的洗脱组分。
- 为了去除10-His标签，加入牛凝血酶（10单位/μl), 10μl 根据制造商的建议，向合并样品中每1 mg蛋白加入凝血酶。
- 透析用于去除过量的咪唑，并降低 NaCl 浓度，以达到离子交换结合所需的水平。进行透析时，裁剪适当长度的 7 kD 截留分子量（MWCO）透析袋，用双蒸水（DDW）清洗，并在一端打结（或用夹子密封）。将合并的蛋白质溶液转移至透析袋中，顶部留出一定空间，然后用夹子夹紧封口。
- 将透析管浸入4升预冷的透析缓冲液（缓冲液D）中，缓慢搅拌过夜 277°K.
- 将透析管从烧杯中取出，剪一个小口，将蛋白质转移至50 ml离心管中。
- 离子交换色谱：将预装的MonoQ 4.6/100 PE柱安装至快速蛋白液相色谱系统（FPLC）。用5个柱体积（CV）的经滤膜过滤的去离子水洗涤柱子。用5 CV的缓冲液D平衡柱子。
- 用双蒸水清洗进样环（两个环体积），再用缓冲液D重复清洗。将蛋白质样品加载至进样环中。
- 注入蛋白样品（流速为1 ml/min），开始收集洗脱组分，用于SDS-PAGE检测未结合的蛋白质。
- 如果初始蛋白体积（步骤 3.23）大于进样环体积，则重复步骤 3.25–3.26，无需清洗进样环，直至全部样品加载至色谱柱上。
- 用3个柱体积的缓冲液C洗涤层析柱，以去除未结合的蛋白质。
- 用缓冲液D之间的40至2000 mM NaCl线性梯度在60分钟内洗脱蛋白质 & E（当100%缓冲液E为梯度洗脱终点时），流速为1 ml/min（尽管可使用更高流速，但会导致洗脱体积增大，蛋白峰浓度降低）。根据280 nm色谱图中出现的蛋白峰进行收集。
- 根据制造商建议清洗预装柱。
- 收集组分的SDS-PAGE分析。应使用以下样品进行该分析：未结合蛋白的穿流组分和蛋白峰穿流组分。按照步骤3.17–3.18中所述方法运行SDS-PAGE并染色。
- 根据预染蛋白质分子量标记，在预测的相对分子质量（Mw）处检测凝胶中是否存在蛋白条带。合并含有目标蛋白的选定洗脱组分。
- 透析合并的样品，以降低进行凝胶过滤层析所需的氯化钠浓度。使用缓冲液F进行透析，操作步骤同3.21–3.23。
- 使用 Vivaspin-15 10,000 MWCO 超滤管，在台式离心机中以 4000 rpm 浓缩蛋白样品至 8 mg/ml。用石英比色皿在 280 nm 处测定吸光度（OD）以确认目标浓度。若蛋白浓度过高，则用缓冲液 F 稀释后再次测定。
- 在FPLC上安装预装好的凝胶过滤层析柱HiLoad 26/60 Superdex 200；用3个柱体积的经滤膜过滤的去离子水洗涤层析柱，随后用3个柱体积的缓冲液F平衡层析柱。
- 用5 ml去离子水（两个环路体积）清洗进样环，随后用等体积的缓冲液F冲洗。进样环中加入的蛋白样品体积不超过4 ml。
- 以3.5 ml/min的流速注入蛋白样品，并在280 nm色谱图中出现蛋白峰时开始收集峰馏分。继续用缓冲液冲洗，直至达到柱体积。
- 如果初始蛋白体积（步骤 3.23）大于进样环体积，则重复步骤 3.25–3.26，期间不清洗进样环，直至全部样品加载至色谱柱上。
- 根据制造商的建议清洗预装柱。
- 收集组分的SDS-PAGE分析。应对蛋白峰样品进行该分析。按照步骤3.17–3.18中所述运行SDS-PAGE并染色。
- 评估凝胶：若蛋白条带特异，且其分子量与预染蛋白标记物预测的大小一致，并仅可见单一条带，则合并该目的蛋白对应的洗脱组分。
- 使用 Vivaspin-15 10,000 MWCO 浓缩蛋白质样品 >20 mg/ml，使用台式离心机在4000 rpm条件下进行。通过在280 nm处测量OD值来验证所需浓度。纯化的MamAΔ41随后浓缩至26.5 mg/ml用于结晶。
- 使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）确认样品纯度和蛋白质鉴定。
- 如果蛋白质已根据质谱仪和SDS-PAGE纯化，则将浓缩的MamAΔ41分装至预先标记的Eppendorf管中；25-50μl 每份中的蛋白质
- 液氮中速冻后于 193°K.
4. 代表性结果
若正确执行本实验方案，应获得高纯度、分子大小均一且浓度较高的蛋白质样品。这些蛋白质样品可直接用于结晶试验以及生化研究，例如酶动力学、结合亲和力分析等。本文描述了纯化方案中主要步骤的代表性结果。Ni-NTA亲和层析柱洗脱组分的SDS-PAGE分析应显示目标蛋白在可溶性组分中大量表达，其分子量约为22 kDa（图1）。该SDS-PAGE分析还应显示，在未结合蛋白的穿流组分、洗涤穿流组分以及超速离心沉淀样品中，目标蛋白含量极低或几乎不存在。若在上述样品中出现明显的目标蛋白条带，则应考虑缓冲液配制错误、细胞破碎过程存在问题，或培养物自诱导条件及生长状态不佳等因素。
离子交换色谱用于分离目标蛋白与结合到镍树脂上的其他大肠杆菌（E.coli）蛋白（由于静电相互作用或富含组氨酸/带负电氨基酸的蛋白环段）以及未切割的带His标签的目标蛋白。该色谱柱通过蛋白质在逐渐增加NaCl浓度条件下与带正电荷树脂的结合亲和力差异实现分离。高度带负电荷的蛋白质将在较高NaCl浓度下洗脱，而中等带负电荷的蛋白质则在较低浓度下洗脱。该色谱柱的优点是具有高流速和高结合容量。离子交换色谱图（图2）显示，在NaCl浓度梯度增加过程中，三种蛋白质组分得到了良好分离。需进行SDS-PAGE分析以确定各组分的分子量，分离目标组分，并评估是否需要进一步纯化步骤。第一个组分为MamAΔ41（约20 kDa），第二个组分为未被牛凝血酶切割的MamAΔ41+His标签蛋白（约22 kDa），第三个组分因浓度过低而在SDS-PAGE中无法检测。如果蛋白峰未能清晰分离，应考虑缓冲液配制错误或调整NaCl梯度斜率。
凝胶过滤色谱用于分离目标蛋白与其他蛋白 E.coli 与Ni-NTA树脂结合且在离子交换层析中未被分离的细胞蛋白。该层析柱根据蛋白质的大小进行分离，大分子蛋白质将在较小的洗脱体积中洗脱，而小分子蛋白质则在较大的洗脱体积中洗脱。层析图谱（图3）显示目标蛋白得到了良好的分离，呈现为一个主要的峰。该峰对应的蛋白洗脱体积符合单体大小，分子量约为20 kDa。此外还观察到约80 kDa条带的存在（E.coli 在上样前通过SDS-PAGE检测到一种典型的结合Ni-NTA树脂的蛋白质（约80 kDa），该蛋白在此次层析过程中消失。由于该蛋白初始浓度较低，其组分在层析图谱中因稀释而不可见，需通过SDS-PAGE分析以确定纯化效率。我们建议将主峰洗脱液的稀释与浓缩样品均上样至SDS-PAGE，以便准确判断目标分子量处是否存在纯蛋白。至此，蛋白已获得高度纯化，其均一性应通过MALDI-TOF质谱进行评估。分析结果显示，一种蛋白的分子量为20347 Da，另一种为10176 Da（图4）。其中约10 kDa的信号峰对应于约20 kDa蛋白的双电荷离子形式。去除His标签后剩余9个氨基酸的MamAΔ41预测分子量为20596.5 Da。与实测的MALDI-TOF分子量相比，二者相差248 Da。此差异可能源于MALDI-TOF检测误差，和/或常见的N端第一个甲硫氨酸与第二个甘氨酸的降解所致。综上，该蛋白已实现高度纯化，可用于后续实验。
表 1. 缓冲液配方。
图 1. Ni-NTA 柱纯化 SDS-PAGE 分析的代表性结果。 从右至左：P- 超速离心沉淀（步骤 3.11）、W- 洗涤液（步骤 3.12）、U- 未结合蛋白（步骤 3.10）、E- 五道洗脱样品（步骤 3.14）、M - 蛋白质标记物（数字表示分子量）。箭头指示 MamAΔ41。
图2. 离子交换层析步骤的分析 (a) 离子交换（MonoQ柱）层析图；蓝色—280 nm处的吸光度，代表蛋白质浓度，绿色—NaCl浓度，红色—收集的组分指示。(b) 离子交换纯化步骤的代表性SDS-PAGE分析。从左至右：M—蛋白质标记物（数字表示分子量），A6—第一峰组分，A8—第二峰组分。
图3. 凝胶过滤层析分析 (a) 凝胶过滤（Superdex 200色谱柱）层析图；蓝色—280 nm处的吸光度，代表蛋白质浓度；红色—收集的组分指示。(b) 凝胶过滤纯化步骤的代表性SDS-PAGE分析。从左至右：M—蛋白质标记物（数字表示分子量），PreI—上样前样品，A4-6—从第一个峰收集并合并的组分，A4-6D—从峰中收集的稀释组分。
图4. 纯化MamAΔ41的基质辅助激光解吸/电离（MALDI-TOF）质谱图。 基质为芥子酸（SA）。MamAΔ41的分子量为20347 Da，同时可见其双电荷离子峰，位于10176 Da。
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讨论
蛋白质纯化是任何蛋白质生化或结构研究中的关键步骤。由于每种蛋白质都具有独特的性质和行为，因此需要明确其特性，并相应地调整纯化方案。应首先利用生物信息学工具对目标蛋白质进行分析，作为纯化的第一步。这些工具可用于计算目标蛋白的等电点，评估其对还原/氧化环境的需求，以及对特殊离子或配体的需求。我们的实验方案包含若干关键性调整，以反映目标蛋白的独特性，这些调整包括缓冲液的选择、工作温度以及层析柱条件的优化。
第一个关键的改进是所使用的缓冲液（第3.3节），需要调整这些缓冲液以反映蛋白质稳定性和功能所需的正确pH范围、离子/配体及离子强度。如果目标蛋白出现任何不稳定的迹象（如降解、沉淀或功能丧失），则需要测试并寻找其他更合适的缓冲液。另一个关键问题是纯化速度和操作温度。为了防止蛋白质降解（由蛋白酶或蛋白质自身不稳定引起），应快速进行纯化，并在277°K下操作（包括使用低温缓冲液、转子和层析柱）。
亲和纯化步骤以及其他层析步骤可以在多种树脂来源上进行。亲和树脂可通过多种技术加载蛋白质，具体方法应根据本地条件进行调整。若通过将蛋白质溶液...
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致谢
我们感谢 Amir Aharoni 博士的支持，以及 Geula Davidov、Noam Grimberg 和 Chen Guttman 提供的建议和意见。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 法国压滤器 | 仪器设备 | 赛默飞世尔科技公司 | FA-078A | |
| 压力细胞 | 仪器设备 | 赛默飞世尔科技公司 | FA-032 | |
| 超速离心机 | 仪器设备 | Sorvall，赛默飞世尔科技 | Discovery 90SE | |
| Rottor | 仪器设备 | 贝克曼库尔特公司 | Ti60 | |
| 超速离心管；PC-瓶盖检测 26.3 ml | 仪器设备 | 贝克曼库尔特公司 | BC-355618 | |
| 2.5 cm 直径，玻璃 Econo-Column 层析柱 | 仪器设备 | Bio-Rad | 737-2521 | |
| Ni-NTA His Bind 树脂 | 仪器设备 | Novagen，EMD Millipore | M0063428 | |
| 分光光度计 | 仪器设备 | Amersham | Ultraspec 2100 pro | |
| 石英比色皿 | 仪器设备 | 赫尔马 | 104-QS | |
| 快速蛋白液相色谱 - AKTA purifier 10 | 仪器设备 | GE Healthcare | 28-4062-64 | |
| 离子交换柱 – MonoQ 4.6/100 PE | 仪器设备 | GE Healthcare | 10025543 | |
| 尺寸排阻预装柱-HiLoad 26/60 Superdex 200 | 仪器设备 | GE Healthcare | 17-1071-01 | |
| Centricon - Vivaspin15 – 10,000 截留分子量 | 仪器设备 | Sartorius AG | VS1501 | |
| 台式离心机 | 仪器设备 | 赛默飞世尔科技公司 | IEC CL30R | |
| MALDI-TOF | 仪器设备 | 布鲁克公司 | Reflex IV | |
| Tris-HCl（羟甲基）氨基甲烷 | 试剂 | 生物实验室 | 20092391 | |
| 氯化钠 | 试剂 | FRUTROM | 235553470 | |
| 咪唑 | 试剂 | Alfa Aesar | 288-32-4 | |
| 无EDTA蛋白酶抑制剂混合物 | 试剂 | Sigma-Aldrich | P-8849 | |
| 脱氧核糖核酸酶 I (DNase I) | 试剂 | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| 牛凝血酶 | 试剂 | Fisher Scientific | BP25432 | |
| 甘氨酸 | 试剂 | 生物实验室 | 07132391 | |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | 试剂 | 生物实验室 | 19822391 | |
| β-巯基乙醇–乙醇 | 试剂 | Sigma-Aldrich | M-3148 | |
| InstantBlue | 试剂 | Expedeon | 1SB01L | |
| PageRuler 预染蛋白标记 | 试剂 | Fermentas | SM0671 |
参考文献
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