小鼠卵母细胞的获取

摘要

本方案阐述了从小鼠输卵管中提取卵母细胞或早期受精胚胎的技术。正确识别漏斗部并将钝端针头插入其中，是成功执行该操作的关键。

摘要

迄今为止，仅有少数研究报道了成功操控鹿鼠属胚胎发育或生殖生物学的方法。我们正与鹿鼠遗传种质中心（http://stkctr.biol.sc.edu）合作，系统表征建立该研究体系所需的关键技术差异。其中一项主要目标是优化卵母细胞和早期胚胎的获取方法。

方案

胚胎/卵母细胞采集

1. 在获取胚胎/卵母细胞前至少两小时，将 KSOM 置于 37ºC 的 CO₂ 培养箱中，同时将 FHM 从 -20°C 解冻。使用一个带有三个凹形浅孔的玻璃培养皿，在培养箱中盛放 KSOM 液滴。为防止脱水，将 KSOM 和培养皿置于带盖容器中，容器底部盛有水。该装置可在不使用矿物油的情况下防止蒸发。
   
   
2. 将排卵雌性个体的输卵管置于 FHM 培养基中。为确保正确的方向性并保持漏斗部完整，需连同输卵管及一小段子宫一并切取部分卵巢组织。使用钝头的 30 号针头，将其插入漏斗部，以将胚胎/卵母细胞从输卵管中推出。必须通过漏斗部获取胚胎，因为输卵管管径过细，针头无法通过。若漏斗部受损，则必须将输卵管切开或用手挤压排出胚胎。
   
   
3. 通过将显微镜聚焦于已沉降至培养皿底部的脂滴，可在 FHM 培养基中找到胚胎/卵母细胞。胚胎/卵母细胞的分离可在 20 倍镜下进行，因其视野范围较高倍镜更大。胚胎/卵母细胞外观呈圆形脂滴状，周围有一圈清晰的光环。使用经拉制的玻璃毛细管并通过口吸移液的方式，将胚胎/卵母细胞转移至 KSOM 中进行培养和后续操作。

卵母细胞采集操作步骤

准备

1. 解冻 FHM 并准备 kSOM。
2. 提前几小时将 kSOM 放入取卵容器中，并置于底部盛有水的吸头盒内，放入 CO₂ 培养箱中。
3. 将笼子带到实验室，处死用于取卵的雌鼠。
4. 切除输卵管时需小心，应保留部分卵巢和部分子宫组织，以确保不切断输卵管的一部分。
5. 将组织置于盛有 FHM 培养基的小培养皿中。
6. 再倒入几份 FHM 培养基至其他培养皿中，用于后续冲洗操作。

 

冲洗

1. 使用连接至带螺旋末端的1 ml注射器的冲洗针（30号钝头）。
2. 一次取一条输卵管，使用针头插入残留卵巢附近部位的漏斗部。若漏斗部已受损无法使用，则用两把镊子夹住输卵管的一端，再用另一把镊子轻轻挤压，如同挤牙膏一般，将其中的胚胎挤出。
   
   注意：这会在培养皿中产生大量碎屑，因为会带出许多组织，因此之后你可能需要使用另一个培养皿。
   
   
3. 观察胚胎时，将显微镜对焦于脂肪组织碎片，寻找周围具有清晰环状结构的圆形“脂肪碎片”。
   
   注意：胚胎的外观与脂肪相同，因此 可能难以发现。胚胎会沉到底部，因此应仔细检查底部。
   
   
4. 对受体雌性小鼠进行阴道涂片检查。在此阶段，它们应处于假孕状态。

讨论

本文演示了从小型鹿鼠（Peromyscus）中获取经促排卵处理（超数排卵）后的卵母细胞。由于超数排卵可获得数量更多的卵母细胞，因此相较于自然动情周期更为常用。然而，在利用此类卵母细胞或胚胎进行研究时，必须谨慎解释实验结果，因为诱导排卵所使用的激素以及体外培养过程均可能对结果产生影响。

确认动情期后，将雌性动物实施安乐死，并回收输卵管以及少量卵巢组织。保留的小部分卵巢可作为识别漏斗部位置的标记。漏斗部紧邻卵巢，通常穿过一层薄薄的组织突出。在该组织的另一侧，输卵管其余部分呈盘绕状，并最终通向阴道。最佳的卵母细胞采集方法是将液体从漏斗部推入，以冲出卵母细胞。此方向是必要的，因为在阴道与输卵管交界处存在一个单向瓣膜。若将卵母细胞反向通过该瓣膜，可能会对其造成损伤。

将一根30号钝端针插入漏斗部。钝端针可与漏斗部开口匹配，但无法插入输卵管管腔。因此，在解剖或取卵过程中必须小心操作，避免损伤漏斗部。若漏斗部受损，可通过镊子挤压输卵管管壁，使滞留的卵母细胞排出。

假...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
冲洗针	工具	Zephyrtronics	ZT5-130-L	30 G 钝头
镊子（2个）	工具	Roboz外科器械公司	RS-5060
Peromyscus	动物	Peromyscus遗传种质中心
剪刀	工具	Roboz外科器械公司	RS-5880
FHM HEPES缓冲培养基	试剂	Specialty Media	MR-025-d
KSOM胚胎培养液（5×10 mL）	试剂	Specialty Media	MR-020P-5F
口吸移液管	工具			由玻璃毛细管拉制并连接橡胶管
卵母细胞培养皿	工具			带凹陷小孔的玻璃容器