利用气相电嗅觉图记录分析小鼠嗅觉感觉神经元的反应

摘要

电嗅图（EOG）记录是一种在嗅觉上皮水平评估嗅觉功能的可靠、易于实施且信息丰富的检测方法。本方案描述了记录装置的搭建、小鼠组织样本的制备、数据采集以及基本的数据分析方法。

摘要

动物依赖嗅觉完成许多关键行为，例如寻找食物来源、躲避捕食者以及识别同种个体以进行交配和其他社会互动。电嗅图（EOG）记录是一种在嗅觉上皮水平评估嗅觉功能的信息丰富、操作简便且可靠的方法。自1956年Ottoson在青蛙中首次描述EOG以来¹，EOG记录已被广泛应用于多种脊椎动物，包括蝾螈、兔子、大鼠、小鼠和人类（参见Scott和Scott-Johnson于2002年的综述，参考文献2）。近年来小鼠基因修饰技术的进步，重新激发了人们对记录EOG以进行基因敲除和基因敲入小鼠嗅觉功能生理表征的兴趣。EOG记录已成功用于证明嗅觉信号转导组分的核心作用^3-8，并最近用于表征某些调控机制对嗅觉感觉神经元（OSN）反应的贡献^9-12。

气味分子的检测发生在嗅觉上皮表面嗅觉感觉神经元（OSNs）的纤毛上，在此处信号转导级联反应导致离子通道开放，产生流入纤毛的电流，从而使膜发生去极化¹³。嗅觉上皮电图（EOG）是指在气味分子刺激下，于嗅觉上皮表面细胞外记录到的负电位，其来源于记录区域内各个有反应的OSNs所引起电位变化的总和²。因此，通过比较EOG的振幅和动力学特征，可获得有关基因修饰及其他实验干预如何影响OSNs对气味分子反应背后分子信号通路的重要信息。

本文介绍了一种在小鼠嗅甲组织标本上进行的气相EOG记录方法。简言之，在处死小鼠后，沿正中矢状面将头部切开并移除鼻中隔，以暴露嗅甲。随后将嗅甲组织标本置于记录装置中，并将记录电极放置于内侧嗅甲之一的嗅上皮表面。参考电极通过缓冲液与组织形成电学连接。持续向嗅上皮表面吹入湿润的气流以保持组织湿润。将气味剂溶液的蒸气脉冲注入湿润气流中以刺激嗅上皮。记录产生的反应信号并进行数字化，以供后续分析。

方案

第一部分：EOG 记录装置的设置

记录装置由记录电极、参考电极、送气管、标本台和解剖显微镜组成，所有部件均固定在法拉第笼内的防震台上。使用显微操作器来定位电极和送气管。持续的气流在通过送气管输送至标本之前，先经蒸馏水鼓泡以增加湿度。使用一个直径为60 mm、内盛6–8 mm深Sylgard的培养皿作为标本的固定平台。在该固定培养皿的Sylgard中挖出一个孔腔和一条通道，用于通过改良林格液将参考电极与标本实现电连接。

记录电极和参考电极连接至放大器。来自放大器的信号被传送至数字化仪，然后传送到计算机。可使用Axograph或pClamp等软件来控制刺激方案、记录信号以及对反应进行后续分析。在放大器之后连接示波器，可在放置记录电极以及进行EOG记录时，方便实时监测电位变化。

气味刺激的递送由Picospritzer控制，该设备与用于信号采集的同一台计算机相连。Picospritzer的气压设定为10 psi。一个空气储罐和调压阀可用于同时为空气台和Picospritzer供气。另需第二个空气储罐和调压阀，以为加湿气流提供空气，因为该气流需要较低的压力和较大的气流量。在递送气味刺激前，将Picospritzer的输出端连接至气味瓶，然后将气味瓶连接至气体递送管。

第二部分：制备电极

记录电极是填充有改良林格溶液（135 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM CaCl₂、1.5 mM MgCl₂、10 mM HEPES，pH 7.4，过滤除菌）的拉制玻璃毛细管内的镀氯化银银丝。参比电极为镀氯化银银丝。

1. 将银丝安装到电极夹持器中。对于记录电极，应使银丝从电极夹持器末端突出1至2厘米。参考电极可保留更长的银丝。
2. 为在银丝上形成氯化银（AgCl）镀层，将银丝置于0.1 M NaCl溶液中，并将电极夹持器连接至1.5–9 V直流电源的正极。电源的负极应与0.1 M NaCl溶液实现电连接。氯化反应持续进行10分钟。在将电极安装至记录装置前，短暂触碰记录电极与参考电极，以平衡两者之间的静电荷。
3. 使用微电极拉制仪拉制玻璃毛细管。毛细管尖端的开口直径应约为5–10微米。
4. 使用钻石刻笔在毛细管钝端划痕并折断，使其长度比银丝长约2厘米。用丁烷喷灯对截断端进行火焰抛光。
5. 在改良Ringer溶液中熔化0.5%琼脂糖。使用移液管吸取少量熔融的琼脂糖溶液，注入电极尖端。
6. 用注射器（经加热拉制使其具有细长末端）将改良Ringer溶液注入拉制好的毛细管约一半深度。轻轻弹击毛细管以排除任何气泡。将填充好的电极存放于储存瓶中，瓶底保留少量改良Ringer溶液，直至使用前。待组织样本制备完成并准备记录时，将填充好的毛细管套在记录电极的银丝上。

第3部分：配制气味溶液

戊酸乙酯和庚醛能够引发显著的反应，因此是作为EOG刺激物的良好选择。

1. 在微量离心管中，用二甲基亚砜（DMSO）配制一系列气味物质的稀释液。作为剂量-反应曲线的起始点，配制从 5 M 到 5 × 10^-6 M 的 10 倍梯度稀释液。每天现配现用。
2. 将上述 DMSO 稀释液进一步用水稀释 50 倍：取 100 μL DMSO 稀释储备液加入含 4.9 mL 水的 2 盎司样品瓶中（瓶口配备硅胶塞）。让溶液在瓶中平衡至少 30 分钟。注意：每个瓶中气味物质的气相浓度未知，但会随液相中气味物质浓度的变化而变化。
3. 将两根 18 号针头插入硅胶塞，作为进气口和出气口。当瓶子不使用时，应将端口堵住。

第4部分：记录EOG并分析数据

1. 通过 CO₂ 安乐死或麻醉过量后断头处死小鼠。去除覆盖颅骨的皮肤，并沿中线将头部矢状向切开成两半。
2. 将其中一半头部（内侧面朝上）固定在固定皿上。小心移除鼻中隔，以暴露鼻甲结构。
3. 将固定有组织的皿放置于记录台上。调整台的位置，使鼻甲上的记录位置位于显微镜视野中心。
4. 打开气罐，向鼻甲表面输送加湿空气。将送气管放置在距离记录位置约 10 mm 处。气流速度约为 600 mL/min。
5. 将放大器设置为直流模式（交流放大会在 EOG 信号中引入伪迹），低通滤波器设为 1 kHz，增益设为 100 倍。
6. 将记录电极和参考电极安装到显微操作器上。
7. 将参考电极插入固定皿的槽内，并用改良的任氏液覆盖，使其与组织形成电连接。
8. 小心地将记录电极降至鼻甲 IIb 或 III 的表面。电极应仅轻微接触嗅上皮表面！当电极接触上皮（即形成闭合电路）时，示波器上将出现一条平稳的基线。
9. 将装有气味物质的瓶子连接至送气管的侧端口。
10. 在计算机上启动刺激程序。数据采集的采样率应为 2 kHz 或更高。软件将触发一次气味脉冲并开始记录。
11. 典型的刺激程序可包括持续 100 毫秒的单次脉冲、间隔 1 秒的成对 100 毫秒脉冲，或持续 10 秒的持续脉冲。
12. 各刺激程序之间应留出一定时间，以尽量减少组织的适应性反应。对于浓度不超过 10^-3 M 的乙酸戊酯和庚醛液体，间隔 1 分钟即可；浓度更高时，应间隔 5 分钟。在施加高浓度气味物质后（如完成剂量-反应曲线的末尾），残留气味可能仍存在于管道中。在继续处理其他组织样本前，应用 95% 乙醇清洗送气管并干燥。
13. Axograph 软件提供用于测量 EOG 信号关键参数的工具。这些参数包括反应幅度、潜伏期、达峰时间以及终止过程的时间常数。在进一步分析前，建议对信号轨迹进行 25 Hz 的数字滤波处理。

代表性结果

图1. EOG分析参数。 多个EOG参数可用于小鼠间反应的比较，包括反应幅度、潜伏期（刺激施加至反应开始之间的时间）、上升时间（反应起始至峰值的时间）、达峰时间（刺激开始至反应峰值的时间）以及终止时间常数（τ，通过将反应衰减相拟合为单指数方程确定）。在比较潜伏期、上升时间和终止时间常数等动力学参数时，建议在分析前对反应的峰值幅度进行归一化处理。

图 2. 不同刺激方案下的代表性电嗅图（EOG）信号。 (a) 小鼠在乙酸戊酯浓度递增刺激下产生的电嗅图示例。面板顶部的黑线表示气味刺激的时间和持续时长。图例中的浓度为液体溶液的浓度。(b) 来自五只小鼠的平均剂量-反应关系。误差条表示95%置信区间。在极高的气味浓度下，通常可观察到峰值幅度下降。(c) 对成对脉冲刺激产生反应的电嗅图示例。一次短暂的单一气味脉冲可引发持续数秒的适应现象。(d) 对持续10秒气味刺激产生反应的电嗅图示例。在持续气味呈现期间，电嗅图显示出脱敏现象。

讨论

采用本方案所述的实验装置，嗅觉上皮表面的气味刺激在不同组织样本之间将保持一致，从而允许在野生型与突变型小鼠之间进行比较，即使确切的气味剂浓度和动态变化尚不明确。多种因素，尤其是记录位置和加湿空气的流速，会导致EOG信号的变异。为尽量减少变异，应从同一鼻甲的相似位置进行记录。这可以通过始终从头部同一侧记录，并在不同组织样本之间保持显微镜、气味递送管和微操作器在气浮台上的位置不变来轻松实现。此外，组织样本在解剖后应立即置于加湿的气流中，以防止组织过度干燥。

在小鼠上进行EOG记录时，也可使用液体灌注装置作用于制备好的小鼠鼻甲^{7, 14, 15}，或保持头部完整，将电极插入鼻甲上方钻出的小孔中^{16, 17}。每种EOG记录方法均有其优势：如本方案所述，对组织标本进行气相记录所需准备最少，操作最为简便；使用液体灌注装置的记录方式便于应用药理学试剂，但许多气味分子的疏水性质会增加气味递送的难度；最后，保持头部完整的记录方式可用于“人工嗅吸”实验，但相较于完全暴露鼻甲的情况，电极放置更为困难。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
空气输送管	设备	定制		可使用带T型接头的1 mL注射器筒体作为替代品
气浮台	设备	Newport Corp.	LW3030B-OPT
放大器	设备	Warner Instruments	DP-301
计算机与数据采集软件	设备	Apple Macintosh 上的 Axograph 4.9.2		适用于 Mac OS X 和 Windows 的 Axograph 更新版本可从 http://axographx.com/ 获取。
丁烷喷灯	设备			使用 crème brûlèe 喷灯效果良好
数字转换器	设备	Axon Instruments	Digidata 1322A
解剖显微镜	设备	Scienscope	SSZ
电极夹持器	设备	Harvard Apparatus	64-1021
磁性固定装置（12 mm）	设备	World Precision Instruments, Inc.	M10
显微操作器	设备	World Precision Instruments, Inc.	M3301R M3301L
微量移液管拉制仪	设备	Sutter Instrument Co.	P2000
示波器	设备	Tektronix, Inc.	5110
Picospritzer III	设备	Parker Hannifin Corporation
硅胶管	设备	Nalge Nunc international
样品台	设备	定制		可使用任何小型固体物体来抬高固定皿。用油泥固定培养皿。
18号针头	材料	BD Biosciences	305195
2盎司玻璃瓶	材料	VWR international	16152-201
玻璃毛细管	材料	World Precision Instruments, Inc.	TW150F-6
16D号硅胶塞	材料	Chemware	D1069809
银丝	材料	World Precision Instruments, Inc.	AGW1010
SylGuard 184	材料	Dow Corning	SYLG184	可从 World Precision Instruments 购得
琼脂糖	试剂	Invitrogen	15510-027
乙酸戊酯	试剂	Aldrich	W504009
氯化钙（CaCl2）	试剂	Sigma-Aldrich	C-1016
二甲基亚砜（DMSO）	试剂	Sigma-Aldrich	D5879
HEPES	试剂	Fisher Scientific	BP310
庚醛	试剂	Aldrich	H2120
六水合氯化镁（MgCl2·6H2O）	试剂	Sigma-Aldrich	M9272
氯化钠（NaCl）	试剂	JT Baker	3624-05
流量计	设备	Gilmont Instruments	GF-2260