番茄分析仪：一种用于从二维物体中收集准确且详尽形态学与色度学数据的实用软件工具

摘要

Tomato Analyzer（TA）能够以可重复且准确的方式量化二维形状和颜色特征。本文描述了获取番茄果实高质量数字化图像、对这些图像进行形态学和颜色分析的逐步操作流程，以及利用该软件生成的数据开展的若干应用。

摘要

以客观且可重复的方式测量果蔬作物的果实形态和颜色性状，对于这些性状的详细表型分析具有重要意义。番茄分析仪（Tomato Analyzer，TA）是一款可半自动、可重复地测量与二维形状相关的37项特征的软件^1,2。其中许多特征，比如果实远端和近端的角度以及凹陷区域的面积，难以通过人工方式进行量化。这些特征在软件中被分为十个类别：基本测量、果实形状指数、棱角度、均匀性、近端果形、远端果形、不对称性、内部偏心度、纬向切面和形态测量学。最后一个类别无需预先了解或预设形状特征，因此形态测量分析提供了一种无偏倚的选择，可能比特征分析更适用于高通量分析。TA还提供“颜色测试”（Color Test）功能，该功能专为从扫描图像中采集颜色数据而设计，并允许使用颜色标准对扫描设备进行校准³。

形态分析工具（TA）提供了多种导出和分析形状属性、形态测量及颜色数据的选项。数据可以批量导出为 Excel 文件（一次处理超过 100 张图像），也可导出为单个图像。用户可选择输出每幅图像中各对象每个属性的平均值（包括标准差），或输出每幅图像中每个对象的属性值。TA 已成为鉴定和验证番茄果实形状数量性状位点（QTL）的有力且有效的工具，同时也可用于深入分析关键果实形状基因对植株形态的影响。此外，TA 还可用于客观地将果实归类到不同的形状类别中。最后，TA 还可用于评估其他植物物种的果实形状和颜色性状，以及叶片、种子等其他植物器官的性状。

方案

Tomato Analyzer（TA）软件旨在识别特定尺寸和图像分辨率（以每英寸点数（dpi）衡量）的物体。该软件可自动确定扫描图像中果实的边界。物体边界通过轮廓追踪确定，从而生成描述图像中物体边界的相邻点列表。所有果实形状的测量均基于这些边界进行计算。“Tomato Analyzer 颜色测试”颜色检测模块旨在量化软件识别边界内的颜色参数。颜色测量基于 RGB 色彩空间：R（红）、G（绿）和 B（蓝）。颜色测试模块获取每个像素的平均 RGB 值，然后将其转换为 CIELAB 色彩空间，该空间使用 L*、a*、b* 来描述颜色，以近似模拟人类视觉感知。颜色测试模块基于 a* 和 b* 计算色调（Hue）和色度（Chroma）颜色参数。

本文介绍了一种对番茄果实进行数字化处理，并利用TA软件包对其进行形态和颜色特征半自动分析的逐步实验方案。该方案分为八个步骤：1）植物材料的选择与准备，2）图像采集，3）软件安装，4）TA颜色测试的图像分析与校准，5）特征的手动调整，6）用户自定义设置，7）数据的保存与导出，以及8）数据分析示例。

1. 植物材料的选择与准备

1. 果实必须清洁且干燥。
2. 多汁果实不应过熟，因为软化可能导致切割时形状变形。
3. 使用锋利的锯齿刀或新的剃须刀片切割果实。根据分析类型及待评估的性状，应沿中心纵向或横向切开果实。颜色分析可用于纵向或横向切开的果实，也可用于其他旨在突出特定特征的切面。
4. 若果实汁液较多，可用纸巾或厨房纸巾轻轻吸干果实内部水分。

2. 图像采集

1. 将果实切开，并将切面朝下放置在扫描仪上。在果实上方放置一把尺子，下方放置标签。尺子用于验证是否选择了正确的扫描分辨率，对于果实性状的准确测量至关重要。为了实现数据的高通量分析，每次扫描应仅限于来自同一植株（或基因型）的果实，并且在同一张扫描图像中，果实应均为纵向切面或均为横向切面，不可混合。将果实紧密排列，但避免相邻果实相互接触。同时避免扫描仪上果实之间存在较大的空白区域。如果物体之间距离过远，则必须在使用TA分析前，使用图像处理软件（如Adobe Photoshop或GIMP）对图像进行处理。
2. 由于TA软件依赖图像分辨率来准确测量尺寸，因此正确选择扫描分辨率对后续分析至关重要。
   1. 一般而言，若物体尺寸在1至8 cm之间，应以200或300 dpi（像素/英寸）进行扫描。若物体尺寸> 8 cm，则以100 dpi扫描。对于非常小的物体（如种子，尺寸< 1 cm），应以750 dpi或更高分辨率扫描。若计划进行批量分析（见下文），且不同植株间的果实尺寸差异不大，则为同一实验中所有图像统一选择一个扫描分辨率设置较为方便。
   2. 进行颜色检测时，若果实尺寸< 8 cm，应将扫描仪分辨率设为200 dpi；若果实尺寸> 8 cm，则设为100 dpi。同时，将输出图像的颜色位数设置为扫描仪支持的最高可用颜色数量。
3. 扫描时应使用黑色或极深色背景，以防止产生干扰分析的阴影。可通过在扫描仪上覆盖纸板箱，使屏幕完全不受外界光线影响，从而获得深色背景。若使用白色背景，TA将无法正常运行，因为该软件针对深色背景进行了优化。
4. 初次扫描后（保存图像前）应对图像进行裁剪，以避免出现大面积空白区域。若此阶段未进行裁剪，则必须在使用TA分析前，通过图像处理软件（如Adobe Photoshop或GIMP）进行裁剪。
5. 若用户希望将RGB值转换为通用的L*、a*和b*色度标度，则在进行颜色分析前需对扫描仪进行校准。色卡扫描（图1）应在果实扫描之前或期间完成。扫描后的色卡图像应与果实图像保存在同一文件夹中。扫描仪校准是必要的，因为不同扫描仪在采集颜色数据时存在差异，且光源在长期反复使用后可能发生改变。
   1. 获取颜色标准并进行扫描。 颜色标准的选择应基于目标作物中观察到的颜色范围。本示例中，我们选用了一种标准的24色还原色卡（ColorChecker，X-Rite，Grand Rapids，MI，图1）。色卡的扫描方式应与果实相同。扫描仪校准的具体操作详见第4.7节。
6. 将扫描图像保存为JPEG格式。
   注意： 在图像采集过程中放置物体时，务必小心且精确。物体排列越整齐，在TA中分析果实时所需的手动调整就越少。图2展示了低质量和高质量图像的示例。

3. 软件安装

1. Tomato Analyzer (TA) 2.2.0.0 版本可从以下网址下载 http://www.oardc.osu.edu/vanderknaap/tomato_analyzer.htm。该 番茄分析仪用户手册 该网站还提供《番茄分析仪颜色测试手册》。
2. TA 需要 Windows 操作系统（版本 2000 或更高）。

4. TA 颜色测试的图像分析与校准

1. 图像文件夹必须放置在硬盘驱动器上，而不能放在“我的文档”文件夹中或远程服务器上。否则，TA 将无法将调整后的图像保存在与原始图像相同的文件夹中。请确保带有 .tmt 扩展名的调整后图像与原始 .jpg 图像位于同一文件夹中（参见步骤 6.1.1）。
2. 通过双击图标的方式启动 TA 程序，如同启动其他任何软件应用程序一样。
3. 用户必须通过从“设置”菜单中选择“扫描仪 DPI”来将 dpi 和测量单位设置为适当的值。dpi 设置必须与图像文件的 dpi 一致，以确保尺寸测量（高度、宽度、周长、面积）的准确性。“单位使用”对话框中的选项将决定数据输出所使用的单位（cm、mm、in 或像素）。在同一对话框中，当对象颜色相对较暗时，可能需要调整亮度。
   注意：DPI 和单位也可以在手动调整完成或图像分析完成后进行调整。
4. 用户可通过从“设置”菜单中选择“保存的测量项”来选择需要测量的属性。此操作可在分析过程中或分析完成后随时进行。这些属性分为十个类别（即基本测量、果实形状指数、块状性、均匀性、近端果实末端形状、远端果实末端形状、不对称性、内部偏心度、纬向截面和形态测量学）。通过点击组名或属性名，可选择或取消选择单个属性或整个测量组。点击“+”可展开显示某个测量组中的所有属性。所选属性将按类别显示在屏幕右下角的窗口中，如图 3 所示。
5. 开始操作时，点击“打开图像”按钮，并从弹出的对话框中选择图像文件。所选图像将显示在左侧窗口中。
6. 要分析已打开的图像，请点击“分析”按钮。分析完成后，每个果实的轮廓将以黄色线条高亮显示，数据将显示在右下角的数据窗口中。软件将自动取消选择过大或过小的对象（例如尺子或标签），这些被取消选择的对象将以蓝色线条高亮显示。可通过右键点击图像中的果实来进一步取消选择其他果实。只有以黄色轮廓标记的项目才会在数据窗口中显示并被导出（见图 3）。以蓝色轮廓标记的项目不会被包含在分析结果中。通过鼠标左键点击右上角窗口中的对象，可单独查看该对象。
   注意：颜色测试模块的数据不会显示在右下角的数据窗口中。
7. 对颜色校正板进行分析以完成颜色分析。
   1. 颜色校正板及 L*、a*、b* 值的采集。 打开扫描得到的颜色校正板图像，并按照果实分析的方法进行分析。确保 TA 将每个色块识别为一个待分析对象（黄色边界）。如果您使用的是标准颜色校正板，软件可能无法识别较暗的色块，这些颜色将不会被包含在校准中。在“设置”菜单下选择“颜色测试”，将弹出对话框。请确保校正参数中斜率值（左侧框）设为 1，y 轴截距值（右侧框）设为 0。最小蓝色值应设为 0，参数 1 和参数 2 可忽略。点击颜色测试对话框内的“分析”按钮，将弹出新窗口用于将输出保存为“CSV”文件，该文件可在 EXCEL 中打开。请指定数据文件的名称和存储路径。输出的数据文件将包含每个色块的 RGB 值、L*、a*、b* 值，以及色调和色度的计算结果。
   2. 确定校准用的校正参数。 将每个色块的 L*、a*、b* 值与颜色计测得的 L*、a*、b* 值（可从颜色校正板制造商处获取或见表 1）进行对比作图。确定回归方程，并记录每个参数的斜率和 y 轴截距。在对话框中，输入 L*、a*、b* 各参数斜率的倒数，并将 y 轴截距的符号取反。这些值将作为“颜色测试”设置中的校正参数使用。
8. 颜色测试功能允许用户定义两个参数，用于报告落在指定色调范围内的像素比例（%）。例如，在番茄分析中，参数 1 的下限和上限值分别为 70 和 100，对应不理想的黄色和黄绿色果肉颜色；参数 2 的下限和上限值分别为 0 和 50，对应理想的红色。请保存这些参数设置。这些设置将应用于所有正在分析的图像，直至程序关闭。对于扫描图像，请选择“Illuminant C 2°”选项；“Illuminant D65 10°”选项仅适用于自然光条件下拍摄的图像。
9. 结果可视化（见图 3）： 右下角数据窗口中的每一行数据对应图像中的一个特定对象，数据排列顺序与图像中对象的位置顺序一致。第一行数据显示图像左上角对象的数值，最后一行数据显示图像右下角对象的数值。点击某一行数据，可在右侧上方窗口中显示对应的果实；反之，点击某个果实，其对应的数据行将被高亮显示。通过点击右下角窗口中的属性标签，可以查看软件如何对每个特定果实进行该属性的测量。例如，点击“远端末端角度”后，软件在左侧窗口中对该果实测量的角度将被显示出来。此功能在识别需要手动调整以提高测量精度的对象时非常有用。
   图 4 显示了使用颜色测试模块进行分析的图像示例。然而，分析结果不会在数据窗口中显示，只能在分析完成后将结果保存为 Excel 文件后访问。

5. 手动调整属性

有时，TA 无法正确识别果实的边界以及近端和远端。此外，如果果实以倾斜角度放置在扫描仪上，则必须调整图像以获得准确的测量结果。这些及其他特征可在初次分析后通过手动调整图像进行校正。可用的调整选项位于“Revise”菜单按钮下，包括：旋转、边界、近端、远端、自动旋转、调整椭圆、调整远端突起、调整果皮边界、默认果皮边界。

注意：如果需要进行调整，应先调整边界，再调整旋转角度。其余所有调整可在完成这两项之后以任意顺序进行。在“修改”菜单下选择的调整项将保持选中状态，直到选择其他调整项为止。这允许用户通过点击切片图像并点击“修改”按钮，对一系列切片执行相同的调整操作。以下详细说明针对不同水果属性的手动调整方法。

1. 边界
   1. 在左窗口中左键单击果实。该果实将显示在右上窗口中。
   2. 单击“Revise”按钮旁边的箭头，并从右上窗口的下拉列表中选择“Boundary”。通过左键单击错误边界的起点和终点，选择需要修改的边界位置。所选边界范围将被移除。
   3. 要添加新边界，从起点向终点方向左键单击。继续点击以沿所需轮廓进行绘制。右键单击可撤销上一步修改。连续右键单击可撤销多次修改。
   4. 按“Enter”键确认新边界。否则按“Esc”键取消此操作。
   5. 单击“Reset Boundary”以恢复至原始边界设置。
2. 旋转。当对象未完全垂直时使用此功能。
   1. 在左窗口中单击相应果实。该果实将显示在右上窗口中。
   2. 单击“Revise”按钮旁边的箭头，并从下拉列表中选择“Rotate”。
   3. 右上窗口中将显示一条轴线。拖动轴线末端的绿色方块，果实将随之旋转。
   4. 在窗口内双击或按“Enter”键完成操作。
   5. 单击“Reset Rotation”以恢复至原始对齐状态。
3. 调整近端。如果近端位置存在误差，则由此特征导出的测量结果将不准确。选择需要调整的果实，使其显示在右侧窗口中。接着，在所选果实下方的数据输出区域中选择“Proximal fruit end shape”标签页以及“Proximal angle micro or macro”列。此时，左侧图像中每个果实的近端角度将被显示出来，从而可识别出异常角度。要更改近端位置，请按以下步骤操作：
   1. 在左窗口中单击目标果实。该果实将显示在右上窗口中。
   2. 单击“Revise”按钮旁边的箭头，并从下拉列表中选择“Proximal End”。
   3. 在右上窗口中，点击并拖动顶点指示器至正确位置。
   4. 双击或按“Enter”键完成操作。
4. 调整远端。对象远端位置也可手动调整。为高效找出需要调整远端的果实，请参照近端调整的相同流程进行操作。
   1. 在左窗口中单击目标果实。该果实将显示在右上角。
      单击“Revise”按钮旁边的箭头，并从下拉列表中选择“Distal End”。
   2. 在右上窗口中，点击并拖动顶点指示器至正确位置。
   3. 双击或按“Enter”键完成操作。
5. 远端突出。此功能允许用户定义尖端边界上的端点。
   1. 在“Distal Fruit End Shape”标签页下，选择标为“Distal End Protrusion”的列，并选择需调整的对象。
   2. 单击“Revise”按钮旁边的箭头，并从下拉菜单中选择“Adjust Distal Protrusion”。
   3. 拖动出现的点，沿边界移动至所需位置。
   4. 按 Enter 键完成操作。一条线将显示尖端区域的截断位置，并重新计算尖端面积。结果将显示在“Distal End Protrusion”列中。若尖端区域位置不理想，可在“Revise”按钮下选择“Reset Distal Protrusion”，将点重置至初始位置。若检测到尖端区域但实际不应存在，可在“Revise”按钮下选择“Eliminate Distal Protrusion”，将点移至果实底部，使“Distal End Protrusion”列的值变为 0.0。
6. 自动旋转。此功能专为番茄种子设计，可自动将其对齐，使尖端朝向一致。目前，自动旋转功能不适用于果实等其他对象。
7. 调整椭圆。此功能允许用户调整内部椭圆的大小和/或位置，以定义果实内部区域。该属性用于TA的“Internal Eccentricity”功能及“Fruit Shape Index Internal”属性。
   1. 选择“Internal Eccentricity”标签页，然后选择该标签页中的任意列。从“Settings”菜单中选择“Default ellipse size”。
   2. 选择一个对象，单击“Revise”按钮，然后从下拉菜单中选择“Adjust Ellipse”。
   3. 将出现两个点，分别代表椭圆的顶部点和左侧点。移动这两个点可同时调整椭圆的大小和中心位置。
   4. 当这两个点被设置到理想位置后，按 Enter 键。椭圆将被重绘。若位置合适，再次按 Enter 键，列中的数值将被更新。
   5. 若需移动内部椭圆而不改变其形状，请单击对象中心（即点所在位置）。将出现两条线和三个绿色点。移动大致位于果实中心的点至新位置，即可在不缩放的情况下移动椭圆。
   6. 按 Enter 键完成操作。
8. 调整果皮边界。此功能允许用户定义果皮区域，当在“Latitudinal section”标签页中选择“Pericarp area”和“Pericarp thickness”时，需进行此项调整。
   注意：对于过熟的果实，可能难以或无法区分果皮与果实其余部分。
   1. 选择一个对象，单击“Revise”下拉菜单。选择“Default pericarp boundary”，并设置最符合果皮情况的默认值。
   2. 如需进一步调整，请从“Revise”下拉菜单中选择“Adjust pericarp boundary”。
   3. 在右上窗口中，选择需要修改的果皮边界位置。通过左键单击错误边界的起点和终点来完成选择。所选边界范围将被移除。为获得最佳效果，每次应选择尽可能小的边界段。
   4. 要添加新边界，从第二点向第一点方向左键单击。继续点击以沿所需轮廓进行绘制。右键单击可撤销上一步修改。连续右键单击可撤销多次修改。
      注意：过多的果皮边界修改可能导致程序崩溃。
   5. 按“Enter”键确认新边界。否则按“Esc”键取消此操作。
   6. 选择“Reset Pericarp Boundary”以将边界恢复至原始位置。
9. 进行颜色分析时，若果肉边界不在果实图像边缘（例如，在果实肩部进行横切，显示横切面上方的果皮，如图4所示），用户需在“Settings”菜单下打开“Color Test”对话框。在此对话框中，需将最小蓝色值设为30并保存。若果实< 3 cm，则将最小蓝色值设为20。若TA在识别正确边界时遇到困难，该值可能需要进一步调整。

6. 用户自定义设置

对于某些属性，用户需要选择进行测量时的设置参数。这可以在分析之前或之后完成，具体取决于实验是否需要在先前使用的相同设置下重复，或者用户是否希望进行探索性分析，以确定新分析的合适设置。

1. 远端和近端块状度的设置。块状度定义为果实远端/近端高度某一用户选定比例处的宽度与中部宽度的比值（图5A）。此参数允许用户选择或调整在物体上的测量位置。通过在“设置”按钮下的“块状度位置”中输入新值，可更改上下块状度的位置。
2. 微角与宏角的设置。这些设置用于计算从果实末端沿边界不同位置处的角度（图5B）。通常，宏角设置适用于沿边界5%至40%范围内的角度，而微角设置适用于2%至10%范围内的角度。
3. 形态测量点的数量。该功能用于在加载图像中每个物体的边界上确定测量点。每个物体的远端和近端均作为基准标志点。可通过“设置”菜单中的“形态测量点数量”（# of morphometric points）来选择沿边界测量的点数，可选范围为4到30个点。软件将自动将所选点数平分为两部分，并在果实远端与近端之间的两侧边界上均匀分布。

7. 保存和导出数据

1. 保存数据
   1. 对图像进行手动调整并由TA完成图像分析后，点击“Save Fruit”按钮。所有当前信息（包括手动调整内容和取消选择的对象）将被保存为一个新文件，该文件与原始图像同名，并具有tmt扩展名。每次选择文件时，与其同名的已保存tmt文件将自动打开，因为该文件与原始图像文件相关联。但tmt文件必须与jpg图像文件存储在同一文件夹中（见第4.1节）。如果软件未将tmt文件和jpg文件保存在同一文件夹中，请将图像文件夹移至C盘。
   2. 若要恢复为原始图像文件（即不包含任何调整），只需删除对应的tmt文件即可。另一种方法是选择“Analyze”并重新分析原始图像。但请注意，除非将新的调整覆盖保存到tmt文件中，否则下次打开该图像文件时，任何与图像同名的tmt文件仍会与之关联。
2. 导出数据
   1. 用户可通过点击“Export”按钮导出单张图像的数据。数据将被导出至Excel文件，并显示每个果实的属性值、平均值和标准差。
   2. TA应用程序还可导出两张或更多图像的属性值（“批量分析”功能）。
      1. 启动批量分析时，点击“Open Image”按钮。
      2. 选择需要进行批量分析的图像文件。在选择其他文件时，可使用“Shift”键或“Ctrl”键进行多选。文件选定后，点击“Open”按钮。
      3. 系统将提示用户选择批量分析输出类型：“仅平均值”、“平均值和标准差”或“每幅图像的单独测量值”。图6展示了两种导出模式的示例。
      4. 为将要创建的Excel文件命名，然后点击“Save”按钮。软件将自动打开文件并开始批量分析。若图像文件此前已由TA分析并保存，则会调用相应的.tmt文件用于批量分析；若文件此前未被分析，则软件将自动对图像进行分析，且不包含手动调整和对象剔除操作。TA可在600 dpi分辨率下对至少100张图像执行批量分析。
      5. 颜色分析的批量分析。在设置菜单中打开“Color Test”选项，勾选“Batch Analysis”并点击Analyze。随后将弹出新窗口以选择待分析的图像。在下一个窗口中指定数据文件的名称和存储路径，点击Save。输出文件将包含每幅图像的名称（基于文件名）以及图像中每个果实的平均颜色值。输出中包含的参数有：参数1、参数2、R、G、B值、亮度、L*、a*、b*值，以及色调（hue）和色度（chroma）值。颜色测试模块可进行最多100张果实图像的批量分析，具体数量取决于计算机硬件性能。

8. 数据分析示例

TA 生成的结果可用于多种应用。在遗传学研究中，该结果被用于检测由不同栽培番茄品种（S. lycopersicum）与野生种 S. pimpinellifolium 接种系 LA1589 杂交所得的多个分离群体中的果实形状数量性状位点（QTL，Quantitative Trait Loci）^1,4,5。TA 还可用于将果实按形状分类⁶，并分析由于生理紊乱“黄肩症”导致的番茄果实着色不良³。此外，该软件还被用于分析其他植物器官，如叶片⁷和种子^8,9。

9. 代表性结果

TA 的输出已被用于多种不同的应用。在果实形状数量性状位点（QTL）研究中，从每个群体共 96 至 130 株植物中采集了果实图像（每张图像包含每株植物 8 到 10 个果实）。随后，这些图像通过 TA^4,5 进行分析。为了检测表型与基因型之间的关联，采用复合区间作图法^10,11以及针对每个群体中部分性状的多性状复合区间作图法进行 QTL 分析¹²。结果鉴定出多个控制番茄果实形状的基因组区域。其中一些区域在多个群体中均存在，而另一些则仅在一个群体中特有。尽管部分果实形状 QTL（如 ovate、sun 和 fs8.1）在此前的定位研究中已有报道，但其他多个位点为新发现。总计在三个分离群体中检测到 17 至 36 个控制果实形状性状的 QTL^2,4。

通过拓扑分析（TA）生成的数据也已采用主成分分析法（PCA）进行分析。在一项研究中，十五个形态属性被用于主成分分析，前三个主成分（PC）随后被作为性状进行定位。数据显示，PC的QTL与构成该主成分的属性QTL存在重叠⁴。研究还利用分离群体，将基于形态测量学鉴定出的QTL与基于形态属性鉴定出的QTL进行比较。结果再次显示，在93%的情况下，形态测量学QTL与控制果实形状和大小属性的QTL相一致²。这些结果明确表明，TA在果实形态分析中所产生的数据具有高度的有效性和可重复性。

TA 的另一个应用是建立果实形状分类系统，通过客观的果实形状测量来鉴定番茄品种。研究人员评估了一个包含约 350 份番茄种质资源的种质库，这些材料来源多样，果实形态各异。每株植物大约选取八个果实进行数字化处理，并使用 TA 进行分析。通过将我们收藏中的果实图像进行视觉比对，评估并比较了现有的两种分类系统：IPGRI¹³ 和 UPOV¹⁴。我们通过合并若干类别并新增两个类别，对这两种系统的形态学分类进行了改进⁶。所提出的类别包括扁平形、圆形、长形、矩形、倒卵形、椭球形、心形和牛心形。从 IPGRI¹³ 和 UPOV¹⁴ 系统改编而来的这八个新类别在视觉上更具可区分性，并通过 TA 测量结果进行了验证。对每份材料 TA 输出的 37 个特征进行了主成分分析（PCA）和线性判别分析（LDA），以确定最能定义每个果实形状类别的测量指标，同时评估这些判别性指标在多大程度上准确解释每份材料的视觉分类结果。该果实形状分类系统的一个可能应用是利用 TA 的输出结果，基于表型数据对种质材料进行聚类，并识别不同果实形状类别之间的关联性。

在源自 S. lycopersicum 加工型品种杂交的近交回交（IBC）群体中，比较了TA中的颜色检测模块与色差仪（CR300）测得的颜色值³。色差仪测得的L*、a*和b*值与通过TA使用三种不同扫描仪获得的颜色值具有可比性。然而，由于硬件、软件或RGB值未标准化，三种扫描仪之间仍存在差异。因此，在颜色检测模块中增加了输入校正值的选项，以实现扫描仪的校准。在一项利用TA颜色检测模块进行的遗传学研究中，颜色及颜色均匀性的遗传方差显著高于使用色差仪测得的结果。这些差异的原因在于，TA可测量整个表面的颜色参数，而色差仪仅分析表面的少数几个点。最后，TA经过测试，已证实能够分析其他作物（如马铃薯、黄瓜、网纹甜瓜和草莓）的颜色及颜色均匀性³。

图1. 颜色测试模块的标准色卡，用于校准从不同扫描仪和不同时间获取的颜色值。

图 2. TA 的正常运行需要高质量的数字化图像。A) 低质量图像示例。TA 将尝试在整个图像中识别物体。当图像中存在较大空白区域（如此处所示）时，TA 可能无法正常工作或发生崩溃。部分果实未吸干表面水分，扫描仪表面的汁液会妨碍 TA 正确识别果实边界。此外，当大多数果实垂直方向放置不正确时，许多参数将无法被准确计算。此类低质量图像将因分析前需进行大量手动调整，而显著降低果实形状分析的速度。B) 高质量图像示例。果实正确垂直摆放，彼此间距紧凑但互不接触，且已吸干表面水分。

图 3. TA 软件界面截图。顶部窗口显示了多个可用工具的按钮（例如：打开图像、保存果实、导出数据、拟合尺寸、分析和修订）。右上窗口中的对象已被选中以进行手动调整，相关数据在右下窗口中显示。该果实的数据在右下角的数据窗口中以灰色高亮显示。左侧窗口中以黄色轮廓标出的对象将被纳入分析，而以蓝色轮廓标出的对象则不会被纳入分析。

图4．用于番茄分析仪-颜色测试应用的一幅图像。

图 5. 用户自定义设置。A) 块状性特征。上部位置用于计算近端块状性和三角形特征。上部位置的设置决定 X 的测量位置（图中为 10%）。下部位置用于计算远端块状性和三角形特征。下部位置的设置决定 Y 的测量位置（图中为 90%）。这些位置的数值等于从果实顶部起算高度的百分比。B) 宏角度特征。绿色线条表示从末端（图中黑色方块）沿边界所取的百分比（图中为 20%），用于测量角度。软件将根据所选值的 ±5% 范围内确定斜率。对于微角度，软件将根据所选值的 ±2% 范围内确定斜率。

图6. 从图3所示图像中使用“导出”工具获得的输出数据示例。A) 显示每个果实的属性值、平均值和标准偏差的输出结果。B) 显示10个番茄品种的平均属性值及其标准偏差的输出结果。

	L*	a*	b*
1	37.986	13.555	14.059
2	65.711	18.13	17.81
3	49.927	-4.88	-21.925
4	43.139	-13.095	21.905
5	55.112	8.844	-25.399
6	70.719	-33.397	-0.199
7	62.661	36.067	57.096
8	40.02	10.41	-45.964
9	51.124	48.239	16.248
10	30.325	22.976	-21.587
11	72.532	-23.709	57.255
12	71.941	19.363	67.857
13	28.778	14.179	-50.297
14	55.261	-38.342	31.37
15	42.101	53.378	28.19
16	81.733	4.039	79.819
17	51.935	49.986	-14.574
18	51.038	-28.631	-28.638
19	96.539	-0.425	1.186
20	81.257	-0.638	-0.335
21	66.766	-0.734	-0.504
22	50.867	-0.153	-0.27
23	35.656	-0.421	-1.231
24	20.461	-0.079	-0.973

表1. 色彩检测卡各色块的L*、a*、b*值（见图1）。光源为D50，观察角为2°。

讨论

植物器官形态和颜色的高通量且准确评估因其定量特性及常依赖主观量化而具有挑战性。表型分析技术（TA）能够以高通量和半自动化的方式，对多种果实形态和色度性状进行客观、准确的测量。已有研究证实了TA的有效性，这些研究成功鉴定了番茄果实形状的数量性状位点（QTL）。^2,4,5此外，利用TA的输出结果还对栽培品种的分类以及一组物种的分类学进行了评估。^15,16番茄果实形状基因SUN的高表达导致果实伸长¹⁷. 利用TA分析，确定了高水平表达SUN基因的品系中叶片和子叶的形态⁷，表明该应用程序也可有效用于测量其他植物器官的形态。此外，TA在鉴定番茄和向日葵种子大小的遗传基础方面也具有关键重要性^8,9最后，TA 中实现的色彩检测模块在分析番茄果实颜色时，比其他方法更为精确、准确且成本更低。总之，TA 已成为对植物器官形态和颜色变异进行客观、可靠评估的关键工具。