番茄分析仪：一种用于从二维物体中收集准确且详尽形态学与色度学数据的实用软件工具

摘要

Tomato Analyzer（TA）能够以可重复且准确的方式量化二维形状和颜色特征。本文描述了获取番茄果实高质量数字化图像、对这些图像进行形态学和颜色分析的逐步操作流程，以及利用该软件生成的数据开展的若干应用。

摘要

以客观且可重复的方式测量果蔬作物的果实形态和颜色性状，对于这些性状的详细表型分析具有重要意义。番茄分析仪（Tomato Analyzer，TA）是一款可半自动、可重复地测量与二维形状相关的37项特征的软件^1,2。其中许多特征，比如果实远端和近端的角度以及凹陷区域的面积，难以通过人工方式进行量化。这些特征在软件中被分为十个类别：基本测量、果实形状指数、棱角度、均匀性、近端果形、远端果形、不对称性、内部偏心度、纬向切面和形态测量学。最后一个类别无需预先了解或预设形状特征，因此形态测量分析提供了一种无偏倚的选择，可能比特征分析更适用于高通量分析。TA还提供“颜色测试”（Color Test）功能，该功能专为从扫描图像中采集颜色数据而设计，并允许使用颜色标准对扫描设备进行校准³。

形态分析工具（TA）提供了多种导出和分析形状属性、形态测量及颜色数据的选项。数据可以批量导出为 Excel 文件（一次处理超过 100 张图像），也可导出为单个图像。用户可选择输出每幅图像中各对象每个属性的平均值（包括标准差），或输出每幅图像中每个对象的属性值。TA 已成为鉴定和验证番茄果实形状数量性状位点（QTL）的有力且有效的工具，同时也可用于深入分析关键果实形状基因对植株形态的影响。此外，TA 还可用于客观地将果实归类到不同的形状类别中。最后，TA 还可用于评估其他植物物种的果实形状和颜色性状，以及叶片、种子等其他植物器官的性状。

方案

番茄分析仪（Tomato Analyzer，TA）软件旨在识别特定尺寸和图像分辨率（以每英寸点数（dpi）衡量）的物体。该软件可自动确定扫描图像中果实的边界。物体边界通过轮廓追踪确定，从而生成描述图像中物体边界的相邻点列表。所有果实形状的测量均基于这些边界进行计算。“番茄分析仪颜色检测”颜色测试模块旨在量化软件所识别边界内的颜色参数。颜色测量基于RGB色彩空间：R（红）、G（绿）和B（蓝）。颜色测试模块获取每个像素的平均RGB值，然后将其转换为CIELAB色彩空间，该空间使用L*、a*、b*来描述颜色，以近似模拟人类视觉感知。颜色测试模块基于a*和b*计算色调（Hue）和色度（Chroma）颜色参数。

本文介绍了一种对番茄果实进行数字化处理，并利用TA软件包对其进行形态和颜色特征半自动分析的逐步实验方案。该方案分为八个步骤：1）植物材料的选择与准备，2）图像采集，3）软件安装，4）TA颜色测试的图像分析与校准，5）特征的手动调整，6）用户自定义设置，7）数据的保存与导出，以及8）数据分析示例。

1. 植物材料的选择与准备

1. 果实必须清洁且干燥。
2. 多汁果实不应过熟，因为软化可能导致切割时形状变形。
3. 使用锋利的锯齿刀或新的剃须刀片切割果实。根据分析类型及待评估的性状，应沿中心纵向或横向切开果实。颜色分析可用于纵向或横向切开的果实，也可用于其他旨在突出特定特征的切面。
4. 若果实汁液较多，可用纸巾或厨房纸轻轻吸干果实内部水分。

2. 图像采集

1. 将水果切开，切面朝下放置在扫描仪上。在水果上方放置一把尺子，下方放置标签。尺子用于验证所选扫描分辨率是否正确，对于水果性状的准确测量至关重要。为了实现数据的高通量分析，每次扫描应仅限于来自同一植株（或基因型）的果实，并且在同一扫描图像中，果实应均为纵向切面或均为横向切面，不可混合。将果实紧密排列，但避免相邻果实相互接触。同时避免扫描仪上果实之间出现大面积空白区域。若物体之间间距过大，则在使用TA分析前，需使用图像处理软件（如Adobe Photoshop或GIMP）对图像进行调整。
2. 由于TA软件利用图像分辨率来精确测量尺寸，因此为后续分析选择合适的扫描分辨率至关重要。
   1. 通常情况下，如果物体尺寸在1至8厘米之间，应以200或300 dpi（像素/英寸）进行扫描。如果物体尺寸 > 8 cm，以100 dpi扫描。对于非常小的（< 对于种子等较小（约1厘米）的物体，应以750 dpi或更高分辨率进行扫描。当计划进行批量分析（见下文）且不同植株间的果实大小差异不大时，为同一实验中所有待采集图像选择相同的扫描分辨率设置较为方便。
   2. 颜色测试时，若水果的扫描分辨率设为200 dpi < 8 cm。如果果实是 >8 cm，以100 dpi分辨率扫描。同时，将输出图像尺寸设置为扫描仪可支持的最大色彩数。
3. 扫描物体时应使用黑色或极深色背景，以防止产生干扰分析的阴影。可通过将纸板箱覆盖在扫描仪上，使屏幕完全避免光线照射，从而获得深色背景。若使用白色背景，TA 将无法正常运行，因为该应用程序针对深色背景的使用进行了优化。
4. 应在初次扫描后（保存图像前）对图像进行裁剪，以避免出现大面积空白区域。如果此阶段未进行裁剪，则必须在使用TA分析前，利用图像处理软件（如Adobe Photoshop或GIMP）对图像进行裁剪。
5. 对于颜色分析，如果用户打算将RGB值转换为通用的L*、a*和b*标度，则需要对扫描仪进行校准。色卡扫描（图1）应在水果扫描之前或同时进行。扫描得到的色卡图像应与水果图像保存在同一文件夹中。扫描仪校准是必要的，因为不同扫描仪在捕获颜色数据时存在差异，且随着使用次数增加，光源可能会发生变化。
   1. 获取颜色标准并进行扫描。 应根据目标作物中观察到的颜色范围选择色标标准。本示例中，我们选用了一种标准的24色还原色卡（ColorChecker，X-Rite，Grand Rapids，MI，图1）。色卡的扫描方式与果实扫描方式相同。扫描仪校准方法见第4.7节。
6. 将扫描的图像保存为 JPEG 文件。
   注意： 在图像采集步骤中，将样本放置于扫描仪上时需小心且精确。样本摆放越整齐，在TraitAnalyzer（TA）中分析果实时所需的手动调整就越少。图2展示了低质量和高质量图像的示例。

3. 软件安装

1. Tomato Analyzer (TA) 2.2.0.0 版本可从以下网址下载 http://www.oardc.osu.edu/vanderknaap/tomato_analyzer.htm。该 番茄分析仪用户手册 该网站还提供《番茄分析仪颜色测试手册》。
2. TA 需要 Windows 操作系统（版本 2000 或更高）。

4. TA 颜色测试的图像分析与校准

1. 图像文件夹必须放置在硬盘驱动器上，而不能放在“我的文档”文件夹中或远程服务器上。否则，TA 将无法将调整后的图像保存在与原始图像相同的文件夹中。请确保带有 .tmt 扩展名的调整后图像与原始 .jpg 图像位于同一文件夹中（参见步骤 6.1.1）。
2. 通过双击图标的方式启动 TA 程序，如同启动其他任何软件应用程序一样。
3. 用户必须通过从“设置”菜单中选择“扫描仪 DPI”来将 dpi 和测量单位设置为适当的值。dpi 设置必须与图像文件的 dpi 一致，以确保尺寸测量（高度、宽度、周长、面积）的准确性。“单位使用”对话框中的选项将决定数据输出所使用的单位（cm、mm、in 或像素）。在同一对话框中，当对象颜色相对较暗时，可能需要调整亮度。
   注意：DPI 和单位也可以在手动调整完成或图像分析完成后进行调整。
4. 用户可通过从“设置”菜单中选择“保存的测量项”来选择需要测量的属性。此操作可在分析过程中或分析完成后随时进行。这些属性分为十个类别（即基本测量、果实形状指数、块状性、均匀性、近端果实末端形状、远端果实末端形状、不对称性、内部偏心度、纬向截面和形态测量学）。通过点击类别或属性名称，可选择或取消选择单个属性或整个测量组。点击“+”可展开显示某一测量组中的所有属性。所选属性将按类别显示在屏幕右下角的窗口中，如图 3 所示。
5. 开始操作时，点击“打开图像”按钮，并从弹出的对话框中选择图像文件。所选图像将显示在左侧窗口中。
6. 要分析已打开的图像，请点击“分析”按钮。分析完成后，每个果实的轮廓将以黄色线条标出，数据将显示在右下角的数据窗口中。软件将自动取消选择过大或过小的对象（例如尺子或标签），这些被取消选择的对象将以蓝色线条标出。可通过右键点击图像中的果实来进一步取消选择其他果实。只有以黄色轮廓标记的项目才会在数据窗口中显示并被导出（见图 3）。以蓝色轮廓标记的项目不会被包含在分析结果中。通过鼠标左键点击右上角窗口中的对象，可单独查看该对象的详细信息。
   注意：颜色测试模块的数据不会显示在右下角的数据窗口中。
7. 对颜色校准板进行分析以完成颜色分析。
   1. 颜色校准板及 L*、a*、b* 值的采集。 打开扫描得到的颜色校准板图像，并按照果实分析的方法进行分析。确保 TA 将每个色块识别为一个待分析对象（黄色边界）。如果使用的是标准颜色校准板，软件可能无法识别较深的色块，这些颜色将不会被包含在校准过程中。在“设置”菜单下选择“颜色测试”，将弹出对话框。请确保校正值中斜率（左侧框）设为 1，y 轴截距（右侧框）设为 0。最小蓝色值应设为 0，参数 1 和参数 2 可忽略。点击颜色测试对话框内的“分析”按钮，将弹出新窗口用于将输出保存为“CSV”文件，该文件可在 EXCEL 中打开。请指定数据文件的名称和存储路径。输出的数据文件将包含每个色块的 RGB 值、L*、a*、b* 值，以及色调和色度的计算结果。
   2. 确定校准用校正参数。 将每个色块的 L*、a*、b* 值与颜色计测得的 L*、a*、b* 值（可从颜色校准板制造商处获取或见表 1）进行对比作图。确定回归方程，并记录每个参数的斜率和 y 轴截距。在对话框中，输入 L*、a*、b* 各参数斜率的倒数，并将 y 轴截距的符号取反。这些值将作为“颜色测试”设置中的校正参数使用。
8. 颜色测试功能允许用户定义两个参数，用于报告落在指定色调范围内的像素比例（%）。例如，在番茄分析中，参数 1 的下限和上限值分别为 70 和 100，对应不理想的黄色和黄绿色果肉颜色；参数 2 的下限和上限值分别为 0 和 50，对应理想的红色。请保存这些参数设置。这些设置将应用于所有正在分析的图像，直至程序关闭。对于扫描图像，请选择“Illuminant C 2°”选项；“Illuminant D65 10°”选项仅适用于自然光条件下拍摄的图像。
9. 结果可视化（见图 3）： 右下角数据窗口中的每一行数据对应图像中的一个特定对象，数据排列顺序与图像中对象的位置顺序一致。第一行数据显示图像左上角对象的数值，最后一行数据显示图像右下角对象的数值。点击某一行数据，可在右侧上方窗口中显示对应的果实图像；反之，点击某个果实，其对应的数据行将被高亮显示。通过点击右下角窗口中的属性标签，可以查看该属性在每个特定果实上的测量方式。例如，点击“远端末端角度”后，软件在左侧窗口中对该果实测量的角度将被显示出来。此功能在识别需要手动调整以提高测量精度的对象时非常有用。
   图 4 显示了使用颜色测试模块进行分析的图像示例。然而，分析结果不会在数据窗口中显示，只能在分析完成后将结果保存为 Excel 文件后访问。

5. 手动调整属性

有时，TA 无法正确识别果实的边界以及近端和远端。此外，如果果实以一定角度放置在扫描仪上，则必须调整图像以获得准确的测量结果。这些及其他特征可在初次分析后通过手动调整图像进行校正。可用的调整选项位于“修订”菜单按钮下，包括：旋转、边界、近端、远端、自动旋转、调整椭圆、调整远端突起、调整果皮边界、默认果皮边界。

注意：如果需要进行调整，应先调整边界，再调整旋转角度。其余所有调整可在完成这两项之后以任意顺序进行。在“修改”菜单下选择的调整项将保持选中状态，直到选择其他调整项为止。这允许用户通过点击切片图像并点击“修改”按钮，对一系列切片执行相同的调整操作。以下详细说明针对不同水果属性的手动调整方法。

1. 边界
   1. 在左侧窗口中左键单击该果实，它将出现在右上方窗口中。
   2. 单击“修订”按钮旁边的箭头，在右上角窗口的下拉列表中选择“边界”。通过左键单击错误边界的起点和终点，选择要修改的边界位置。随后，所划定的边界将被移除。
   3. 从起点向终点左键单击以添加新边界。持续点击以沿所需轮廓进行绘制。右键单击可撤销上一次修改。连续右键单击可依次撤销多次修改。
   4. 要确认新边界，请按“Enter”键；否则，按“Esc”键以取消此操作。
   5. 单击“重置边界”以恢复至原始边界设置。
2. 旋转此功能用于对象不完全垂直时。
   1. 单击左侧窗口中相应的水果，该水果将显示在右上角的窗口中。
   2. 单击“修订”按钮旁边的箭头，然后从下拉列表中选择“旋转”。
   3. 右上角窗口将显示一个坐标轴。拖动坐标轴末端的绿色方块，果实将随之旋转。
   4. 双击窗口内部或按“Enter”键以完成。
   5. 单击“重置旋转”以恢复至原始对齐状态。
3. 调节近端如果近端位置存在误差，则由此特征导出的测量结果将不准确。选择一个需要调整的果实，使其显示在右侧窗口中。接着，在所选果实下方的数据输出区域，点击“果实近端形状”标签和“近端角度微调或宏调”选项。此时，左侧图像中每个果实的近端角度将被显示出来，从而可识别出明显异常的角度值。如需调整近端位置，请按以下步骤操作：
   1. 单击左侧窗口中所需的水果，该水果将显示在右上方窗口中。
   2. 单击“修订”按钮旁边的箭头，然后从下拉列表中选择“近端”。
   3. 在右上角窗口中，单击并拖动顶点指示器至正确位置。
   4. 双击或按“Enter”键完成。
4. 调节远端末端物体远端的位置也可以手动调整。为了高效地找到需要调整远端的果实，请遵循与近端相同的操作步骤。
   1. 单击左侧窗口中所需的水果，它将显示在右上角。
      单击“修订”按钮旁边的箭头，然后从下拉列表中选择“远端”。
   2. 在右上角窗口中，单击并拖动顶点指示器至正确位置。
   3. 双击或按“Enter”键完成。
5. 远端突出该功能允许用户定义针尖边界上的端点。
   1. 在“果实远端形状”选项卡下，选择标有“远端突出”的列，并选择要调整的对象。
   2. 单击“修订”按钮旁边的箭头，然后从下拉菜单中选择“调整远端突出”。
   3. 将出现的点沿边界拖动至所需位置。
   4. 按 Enter 键完成。将显示一条线，标示出顶端区域的截断位置，并重新计算顶端面积。结果将显示在“远端突出”列中。如果顶端区域位置不符合预期，可点击“修订”按钮下的“重置远端突出”选项，将各点恢复至初始位置。若检测到顶端区域但实际上不应存在，可选择“修订”按钮中的“消除远端突出”选项，将各点移至果实底部，从而使“远端突出”列的数值变为 0.0。
6. 自动旋转该功能专为番茄种子设计，可使其自动对齐，尖端朝向同一方向。目前，自动旋转功能不适用于果实等其他物体。
7. 调整椭圆此功能允许用户调整内部椭圆的大小和/或位置，以定义果实内部区域。该属性用于TA的“内部偏心率”功能及“果实形状指数-内部”属性。
   1. 选择“内部偏心率”选项卡，然后点击该选项卡中的任意列。从“设置”菜单中选择“默认椭圆大小”。
   2. 选择一个对象，然后点击“Revise”按钮。从下拉菜单中选择“Adjust Ellipse”。
   3. 将出现两个点，分别代表椭圆的顶部和左侧端点。移动这两个点可相对于新的位置调整椭圆的大小和中心。
   4. 一旦这些点被调整到理想位置，按下回车键，椭圆将被重新绘制。如果位置合适，再次按下回车键，各列中的数值将被更新。
   5. 如果需要移动内部椭圆而不改变其形状，请单击对象中心原先存在标记点的位置。此时将显示两条直线和三个绿色标记点。拖动位于果实中心附近的位置点至新位置，即可在不缩放椭圆的情况下完成移动。
   6. 按 Enter 键完成。
8. 调整果皮边界此功能允许用户定义果皮区域，当在“横向切片”选项卡中选择“果皮面积”和“果皮厚度”时，需要对此进行调整。
   注意对于过熟的果实，可能难以或无法将果皮与果实其余部分区分开来。
   1. 选择一个对象，点击“修订”下拉菜单。选择“默认果皮边界”，并设置最适合果皮的默认值。
   2. 如需进一步调整，请从“修订”下拉菜单中选择“调整果皮边界”。
   3. 在右上角窗口中，选择需要修改的果皮边界位置。通过左键单击错误边界的起点和终点来完成此操作。相应地，所划定的边界将被移除。为获得最佳效果，每次应选择尽可能小的边界片段。
   4. 从第二个点向第一个点左键单击以添加新边界。继续单击以沿所需轮廓绘制。右键单击可撤销上一步修改。连续右键单击可依次撤销多次修改。
      注意：过多的果皮边界修改可能导致程序崩溃。
   5. 要确认新边界，请按“Enter”键；否则，按“Esc”键以取消此操作。
   6. 选择“重置果皮边界”以将边界恢复至原始位置。
9. 对于颜色分析，当果肉边界不在果实图像边缘时（例如在果实肩部进行的横切，此时横切面上方显示果皮，如图4所示），用户需要在“设置”菜单下打开“颜色测试”对话框。在该对话框中，需将最小蓝色值设置为30并保存。如果果实是 < 3 cm，将蓝色最小值设置为20。如果TA在寻找正确边界时遇到困难，该值可能需要进一步调整。

6. 用户自定义设置

对于某些属性，用户需要选择进行测量时的设置参数。此操作可在分析之前或之后进行，具体取决于实验是否需在先前使用的相同设置下重复，或用户是否希望进行探索性分析，以确定新分析的合适参数设置。

1. 远端和近端块状度的设置。块状度定义为果实远端/近端高度某一用户指定比例处的宽度与中部宽度的比值（图5A）。该参数允许用户选择或调整在物体上的测量位置。通过在“设置”按钮下的“块状度位置”中输入新数值，可更改上下块状度的位置。
2. 微角与宏角的设置。这些设置用于计算果实末端沿边界不同位置处的角度（图5B）。通常，宏角设置适用于沿边界5%至40%范围内的角度，而微角设置适用于2%至10%范围内的角度。
3. 形态测量点的数量。此功能用于在加载图像中每个物体的边界上确定测量点。每个物体的远端和近端均作为基准标志点。可通过“设置”菜单中的“形态测量点数量”（# of morphometric points）来选择沿边界测量的点数，可选范围为4到30个点。软件将自动将所选点数平分为两部分，并在果实远端与近端之间的两侧边界上均匀分布。

7. 保存和导出数据

1. 保存数据
   1. 对图像进行手动调整并由TA完成图像分析后，点击“Save Fruit”按钮。所有当前信息，包括手动调整内容和已取消选择的对象，将被保存为一个新文件，文件名与原始图像相同，并带有tmt扩展名。每次选择文件时，与该文件同名的已保存tmt文件将自动打开，因为其与原始文件相关联。但tmt文件必须与jpg图像文件存储在同一文件夹中（见第4.1节）。如果软件未将tmt文件和jpg文件保存在同一文件夹中，请将图像文件夹移至C盘。
   2. 若要恢复为原始图像文件（不包含任何调整），只需删除对应的tmt文件即可。另一种方法是选择“Analyze”并重新分析原始图像。但请注意，除非将新的调整覆盖保存到tmt文件中，否则下次打开该图像文件时，任何与图像同名的tmt文件仍会与该图像相关联。
2. 导出数据
   1. 用户可通过点击“Export”按钮导出单张图像的数据。数据将被导出至一个Excel文件，其中显示每个果实的属性值、平均值和标准差。
   2. TA应用程序还可导出两张或更多图像的属性值（“Batch Analysis”功能）。
      1. 启动批量分析时，点击“Open Image”按钮。
      2. 选择需要进行批量分析的图像文件。使用“Shift”键或“Ctrl”键可同时选择多个文件。选择完成后，点击“Open”按钮。
      3. 系统将提示用户选择批量分析输出类型：“Average Only”（仅平均值）、“Average and Standard Deviation”（平均值和标准差）或“Individual Measurements per image”（每幅图像的独立测量值）。图6展示了两种导出模式的示例。
      4. 为将要创建的Excel文件命名，然后点击“Save”按钮。软件将自动打开文件并开始批量分析。若图像文件此前已由TA分析并保存，则会调用已保存的.tmt文件进行批量分析；若文件此前未被分析，软件将自动对图像进行分析，但不包含手动调整和取消选择操作。TA可在600 dpi下对至少100张图像执行批量分析。
      5. 颜色分析的批量分析。在设置菜单中打开“Color Test”选项。勾选批量分析（Batch Analysis）并点击Analyze。随后将弹出新窗口用于选择待分析的图像。在下一个窗口中指定数据文件的名称和存储路径，然后点击Save。输出文件将包含每幅图像的名称（基于文件名）以及图像中每个果实的平均颜色值。输出中包含的参数有：参数1、参数2、R、G、B值、亮度、L*、a*、b*值，以及色调（hue）和色度（chroma）值。颜色测试模块可进行批量分析，最多支持100张果实图像，具体数量取决于计算机硬件配置。

8. 数据分析示例

TA 生成的结果可用于多种应用。在遗传学研究中，该结果被用于检测由不同栽培番茄品种（S. lycopersicum）与野生种 S. pimpinellifolium 接种系 LA1589 杂交所得的多个分离群体中的果实形状数量性状位点（QTL，Quantitative Trait Loci）^1,4,5。TA 还可用于将果实按形状分类⁶，并分析由于生理紊乱“黄肩症”导致的番茄果实着色不良³。此外，该软件还被用于分析其他植物器官，如叶片⁷和种子^8,9。

9. 代表性结果

TA 的输出已被用于多种广泛的应用。在果实形状 QTL 研究中，从每个群体的 96 至 130 株植物中采集了果实图像（每张图像包含每株植物 8 到 10 个果实）。随后，这些图像通过 TA^4,5 进行分析。为了检测表型与基因型之间的关联，采用复合区间作图法^10,11以及针对每个群体中部分性状的多性状复合区间作图法¹²进行 QTL 分析。结果鉴定出多个控制番茄果实形状的基因组区域。其中一些区域在多个群体中均存在，而另一些则仅在一个群体中特有。尽管部分果实形状 QTL（如ovate、sun 和 fs8.1）在此前的定位研究中已有报道，但仍有多个其他位点为新发现。总计在三个分离群体中检测到 17 至 36 个控制果实形状性状的 QTL^2,4。

通过拓扑分析（TA）生成的数据还采用了主成分分析法（PCA）进行分析。在一项研究中，十五个形态属性被用于主成分分析，前三个主成分（PC）随后被作为性状进行定位。数据显示，主成分的QTL与构成该主成分的各属性的QTL存在重叠⁴。研究还利用分离群体，将基于形态测量学方法鉴定出的QTL与基于形态属性鉴定出的QTL进行比较。结果再次显示，在93%的情况下，形态测量学QTL与控制果实形状和大小属性的QTL一致²。这些结果明确表明，TA在果实形态分析中所产生的数据具有高度的有效性和可重复性。

TA 的另一个应用是建立果实形状分类系统，通过客观的果实形状测量来鉴定番茄品种。研究人员评估了一个包含约 350 份番茄种质资源的种质库，这些材料来源多样，果实形态各异。每株植物大约选取八个果实进行数字化处理，并使用 TA 进行分析。通过将我们收集的果实图像进行视觉比对，评估并比较了现有的两种分类系统：IPGRI¹³ 和 UPOV¹⁴。我们通过合并若干类别并新增两个类别，对这两种系统的形态学分类进行了改进⁶。所提出的类别包括扁平形、圆形、长形、矩形、倒卵形、椭球形、心形和牛心形。从 IPGRI¹³ 和 UPOV¹⁴ 系统改进而来的这八个新类别在视觉上更具可区分性，并通过 TA 测量结果进行了验证。对每份材料获得的 37 项 TA 特征数据进行了主成分分析（PCA）和线性判别分析（LDA），以确定最能定义每种果实形状类别的测量指标，同时评估这些判别性指标在多大程度上能够准确解释每份材料的视觉分类结果。该果实形状分类系统的一个可能应用是利用 TA 的输出结果，基于表型数据对种质材料进行聚类，并识别不同果实形状类别之间的关联性。

在源自加工型番茄（S. lycopersicum）品种间回交所建立的近交回交（IBC）群体中，比较了TA中的颜色检测模块与色度计（CR300）测得的颜色数据³。色度计测得的L*、a*和b*值与使用TA通过三种不同扫描仪获得的颜色值具有可比性。然而，由于硬件、软件或RGB值未标准化，三种扫描仪之间仍观察到差异。因此，Color Test模块中增加了输入校正值的选项，以实现扫描仪的校准。在一项利用TA的Color Test模块进行的遗传学研究中，颜色及颜色均匀性的遗传方差显著高于使用色度计所获得的结果。这些差异的原因在于，TA可测量整个表面的颜色参数，而色度计仅能分析表面的少数几个点。最后，TA还被测试用于分析其他作物（如马铃薯、黄瓜、甜瓜和草莓）的颜色及颜色均匀性，并表现出良好的适用性³。

图1. 颜色测试模块的标准色卡，用于校准从不同扫描仪及不同时间获取的颜色值。

图 2. 表型分析（TA）的正常运行需要高质量的数字化图像。A) 低质量图像示例。TA 将尝试在整个图像中识别物体。当图像中存在较大空白区域（如此处所示）时，TA 可能无法正常工作或发生崩溃。部分果实未吸干表面水分，扫描仪玻璃板上的汁液会妨碍 TA 正确识别果实边界。此外，当大部分果实垂直方向放置不正确时，许多形态参数将无法被准确计算。此类低质量图像将因分析前需进行大量手动调整，而显著降低果实形状分析的效率。B) 高质量图像示例。果实正确地垂直摆放，彼此间距紧凑但互不接触，且已吸干表面水分。

图3. TA软件的界面截图。顶部窗口显示了多个可用工具的按钮（例如，打开图像、保存果实、导出数据、调整大小、分析和修改）。右上窗口中的对象已被选中以进行手动调整，相关数据在右下窗口中显示。该果实的数据在右下角的数据窗口中以灰色高亮显示。左侧窗口中用黄色轮廓标记的对象将被纳入分析，而用蓝色轮廓标记的对象则不会被纳入分析。

图4．用于番茄分析仪-颜色检测应用的图像。

图 5. 用户自定义设置。A) 块状性特征。上部位置用于计算近端块状性和三角形特征。“上部位置”的设置决定 X 的测量位置（图中为 10%）。下部位置用于计算远端块状性和三角形特征。“下部位置”的设置决定 Y 的测量位置（图中为 90%）。这些位置的数值表示从果实顶部起算的高度百分比。B) 宏角度特征。绿色线条表示从末端（图中黑色方块处）沿边界所取的百分比位置（图中为 20%），用于测量角度。软件将根据所选值的 ±5% 范围内确定斜率。对于微角度，软件将根据所选值的 ±2% 范围内确定斜率。

图6. 使用图3所示图像通过导出工具获得的输出数据示例。A) 显示每个果实的属性值、平均值和标准差的输出结果。B) 显示10个番茄品种的平均属性值及其标准差的输出结果。

	L*	a*	b*
1	37.986	13.555	14.059
2	65.711	18.13	17.81
3	49.927	-4.88	-21.925
4	43.139	-13.095	21.905
5	55.112	8.844	-25.399
6	70.719	-33.397	-0.199
7	62.661	36.067	57.096
8	40.02	10.41	-45.964
9	51.124	48.239	16.248
10	30.325	22.976	-21.587
11	72.532	-23.709	57.255
12	71.941	19.363	67.857
13	28.778	14.179	-50.297
14	55.261	-38.342	31.37
15	42.101	53.378	28.19
16	81.733	4.039	79.819
17	51.935	49.986	-14.574
18	51.038	-28.631	-28.638
19	96.539	-0.425	1.186
20	81.257	-0.638	-0.335
21	66.766	-0.734	-0.504
22	50.867	-0.153	-0.27
23	35.656	-0.421	-1.231
24	20.461	-0.079	-0.973

表1. 色彩检测卡各色块的L*、a*、b*值（见图1）。光源为D50，观察角为2°。

讨论

植物器官形态和颜色的高通量且准确评估因其定量特性及常依赖主观量化而具有挑战性。表型分析技术（TA）能够以高通量和半自动化的方式，对多种果实形态和色度性状进行客观、准确的测量。已有研究证实了TA的有效性，这些研究成功鉴定了番茄果实形状的数量性状位点（QTL）。^2,4,5此外，利用TA的输出结果还对栽培品种的分类以及一组物种的分类学进行了评估。^15,16番茄果实形状基因SUN的高表达导致果实伸长¹⁷. 利用TA分析，确定了高水平表达SUN基因的品系中叶片和子叶的形态⁷，表明该应用程序也可有效用于测量其他植物器官的形态。此外，TA在鉴定番茄和向日葵种子大小的遗传基础方面也具有关键重要性^8,9最后，TA 中实现的色彩检测模块在分析番茄果实颜色时，比其他方法更为精确、准确且成本更低。总之，TA 已成为对植物器官形态和颜色变异进行客观、可靠评估的关键工具。