本视频展示了体外血管生成实验的方案，该实验可重现血管生成的多个阶段。展示了出芽、管腔形成、分支和吻合——血管生成的关键特征——的时间推移图像。
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本文内容
摘要
摘要
血管生成是一个复杂的多步骤过程，在血管生成刺激因子的作用下，由现有脉管系统形成新的血管。这些步骤包括：基底膜降解、内皮细胞（EC）在细胞外基质中增殖和迁移（出芽）、内皮细胞排列成索状结构、分支、管腔形成、吻合以及新基底膜的形成。目前已开发出多种体外检测方法用于研究该过程，但大多数方法仅能模拟血管生成的某些阶段，且检测中形成的血管结构在形态上通常与体内血管存在差异。基于Nehls和Drenckhahn的前期工作，我们优化了一种利用人脐静脉内皮细胞和成纤维细胞的体外血管生成检测模型。该模型可重现血管生成的所有关键早期阶段，更重要的是，所形成的血管具有由极化内皮细胞包绕的通畅细胞间管腔。实验中将内皮细胞接种于Cytodex微载体表面，并嵌入纤维蛋白凝胶中，成纤维细胞则铺在凝胶表面，提供促进微载体表面内皮细胞出芽所必需的可溶性因子。数天后可观察到大量形成的血管结构，可通过相差显微镜和延时显微成像轻松观察。本视频展示了建立该培养体系的关键操作步骤。
关键词：血管生成，体外检测，人脐静脉内皮细胞，成纤维细胞，纤维蛋白凝胶，管腔形成，Cytodex微载体，延时显微成像
方案
细胞准备
- 在包被前1-2天，用M199培养基加10% FBS和青霉素-链霉素（1:100）培养HUVEC和成纤维细胞。
- 在HUVEC成球前一天以及成纤维细胞包埋前一天，更换为EGM-2培养基（Clonetics）。
- A 每微球约需 400 个 HUVEC。
- 每孔需要 20,000 个成纤维细胞。
用HUVEC包被磁珠 - 第-1天
- 用胰蛋白酶处理 HUVEC。
- 让微珠自然沉降（切勿离心！）。吸除上清液，并用 1 mL 温热的 EGM-2 培养基短暂洗涤微珠。
- 在 FACS 管中，将 2500 个微珠与 1×106 个 HUVEC 混合于 1.5 mL 温热的 EGM-2 培养基中。将管子垂直放置于培养箱内。（此量适用于约 10 个孔，可根据需要按比例放大）
- 在 37°C 下孵育 4 小时，每隔 20 分钟轻轻摇动一次管子。（良好的包被对出芽至关重要。）
- 4 小时后，将包被好的微珠转移至含 5 mL EGM-2 培养基的 T25 培养瓶中，过夜静置。
将包被珠嵌入纤维蛋白凝胶中 - 第0天
- 配制 2.0 mg/mL 的纤维蛋白原溶液（参见配方部分）。
- 向....
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讨论
目前人们日益达成共识：三维（3D）体外血管生成实验所提供的模型比二维培养更接近体内真实环境。显然，理想的三维系统应具备可重复性，并能够模拟血管生成的多个主要阶段。尽管已有多种三维实验方法被开发出来，但其中许多方法要么依赖难以获取的微血管内皮细胞，要么仅能重现部分发育阶段。在本视频中，我们描述并演示了一种经过优化的体外血管生成实验方法，该方法采用人脐静脉内皮细胞（EC），这类细胞易于获取，也是血管研究中最常用的内皮细胞类型。该实验在数天内可稳定地形成具有清晰、通畅的细胞间管腔且被极化内皮细胞包围的长管状结构。同时还能观察到内皮细胞分支及血管融合（即吻合）的后期阶段。重要的是，在这些培养体系中，HUVEC 经历了与微血管内皮细胞在体内或体外所见完全相同的全部形态学变化，包括出芽、迁移、排列、增殖、成管、分支以及吻合等过程。同时，HUVEC 的基因表达谱也发生相应改变，更趋近于微血管内皮细胞的表达特征。综上所述，我们提出了一种优化的体外血管生成模型方案，能够重现该过程中的多个关键阶段。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 微载体Cytodex-3珠 | 试剂 | Amersham | 17-0485-01 | 10 g/瓶。取1.0.5 g干燥珠粒，加入50 mL PBS（pH = 7.4）中，室温下水化溶胀至少3小时。使用50 mL离心管并置于摇床上。2. 静置使珠粒沉降（约15分钟），弃上清液，用新鲜PBS（50 mL）洗涤数分钟。3. 弃去PBS，加入新鲜PBS：25 mL -> 20 mg/mL => 60000 珠粒/mL，或50 mL -> 10 mg/mL => 30,000 珠粒/mL。4. 将珠悬液转移至硅化玻璃瓶（如Windshield Wiper或Sigmacote处理过的瓶子）中。5. 在115°C下高压灭菌15分钟，对珠粒进行灭菌。6. 4°C保存。 |
| 抑肽酶 | 试剂 | Sigma-Aldrich | A-1153 | 10 mg/瓶。用去离子水将冻干粉配制成4 U/mL溶液，经无菌滤器过滤，分装为每管1 mL，-20 °C保存。 |
| 纤维蛋白原 I型 | 试剂 | Sigma-Aldrich | F-8630 | 1 g。将纤维蛋白原溶解于DPBS中，终浓度为2 mg/mL。注意可凝固蛋白的百分比，并据此调整浓度。在37 °C水浴中加热溶解，通过倒置混匀，禁止涡旋震荡。使用0.22 µm滤器无菌过滤。 |
| 凝血酶 | 试剂 | Sigma-Aldrich | T-3399 | 22 mg = 1,000单位。用无菌水配制成50 U/mL溶液，分装为每管0.5 mL，-20 °C保存。 |
参考文献
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro. Histochem Cell Biol. 104, 459-466 (1995).
- Nehls, V., Drenckhahn, D.
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