在芽殖酵母中的蛋白浓度的功能形态学表型的发展分析

Summary

基因缺失和蛋白表达研究蛋白质功能的常用方法。在这篇文章中，我们描述了作为一个人口功能的蛋白浓度和单细胞水平分析表型的发展协议酿酒酵母。

Abstract

基因缺失和蛋白表达研究蛋白质功能的常用方法。在这篇文章中，我们描述了作为一个人口功能的蛋白浓度和单细胞水平分析表型的发展协议

Protocol

A.细胞培养和蛋白质感应

本节介绍了细胞培养条件下，从regulatable启动子在酵母细胞中蛋白表达诱导细胞周期同步，与噻氨酯哒唑。

1. 在野生型酵母株W303（LEU2 - 3，112 TRP1 - 1 CAN1 - 100 URA3 - 1 ADE2 - 1 HIS3 - 11，15）是转变高复制（2μ）的质粒DNA，包含的控制下我们感兴趣的基因（ENTH2）蛋氨酸repressible子（MET25）。 2MM蛋氨酸足以抑制启动子活性，而缺乏蛋氨酸的媒体允许的最大表达。因此，蛋氨酸浓度范围内可用于表达蛋白质的理想水平。 1 W303细胞的质粒DNA转化LiAc - TE的方法是使用按标准程序。
   注意:此试验应执行中存在2mm的蛋氨酸，以确保只在背景水平蛋白表达的细胞生长隔夜。第二天早晨，蛋白表达应引起resuspending细胞缺乏蛋氨酸紧随细胞周期同步（约4小时）的媒体 。 然而，我们发现，ENTH2依赖细胞分裂表型诱导后，才在相当集中的ENTH2已建成的细胞（通常在4 - 6H蛋白诱导^3），使所有表现形式的分析日久非常冗长（至少16小时）的表型。我们发现，越来越多的细胞在0.2MM蛋氨酸的存在一夜之间压抑形态的表型，但允许亚临界蛋白浓度，可以迅速提高到表型诱导水平转移到媒体缺乏蛋氨酸。 这允许在相对 ​​较短的时间内....

Discussion

本协议描述了如何监督的形态学表型蛋白表达（酵母细胞无法进行正常的细胞分裂）后的发展。执行此过程时，重要的是要记住造粒建议离心速度更快的速度可能会损伤细胞和晦涩的结果收获的酵母细胞。应增加活细胞成像前，因为它们是有毒的亚甲基蓝和Calcofluor白色。此过程也可以很容易地适应蛋白质镇压条件下观察到表型的目标是从一个可控的发起人表示。

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
诺考达唑	试剂	Sigma-Aldrich	M1404
亚甲蓝 1% （w/v）	试剂	VWR international	VW6276-0
钙氟白色	试剂	Sigma-Aldrich	F3543
凡士	试剂	VWR international	VW3339-2