酿酒酵母中蛋白质浓度依赖的形态表型发育分析

摘要

基因删除和蛋白质过表达是研究蛋白质功能的常用方法。本文中，我们描述了一种在群体水平和单细胞水平上分析酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中蛋白质浓度依赖性表型发育的实验方案。

摘要

基因敲除和蛋白过表达是研究蛋白质功能的常用方法。在本文中，我们描述了一种在群体和单细胞水平上，作为蛋白质浓度函数分析表型发育的实验方案Saccharomyces cerevisiae. 尽管本实验方案基于蛋白质的过表达，但也可轻松调整用于依赖于蛋白表达抑制的形态学表型研究。我们实验室致力于研究内吞作用适配器蛋白epsin的信号传导特性。为此，我们采用了一种显性负性策略，即过表达其保守的EpsinN-TerminalH为了干扰内源性epsin-2（Ent2或YLR206W）的功能，我们表达了epsin-2的氨基末端同源结构域（ENTH结构域）。我们观察到，在野生型细胞中过表达Ent2的ENTH结构域（ENTH2）会导致细胞分裂缺陷，该缺陷依赖于一组支架蛋白——分裂素（septins）的错误定位。

方案

A. 细胞培养与蛋白诱导

本部分介绍了细胞培养条件、使用诺考达唑进行细胞周期同步化，以及随后在酵母细胞中通过可调控启动子诱导蛋白表达的方法。

1. 将野生型酵母菌株 W303（leu2-3,112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11,15）用含有目的基因（ENTH2）的高拷贝（2μ）质粒 DNA 进行转化，该基因受甲硫氨酸可抑制启动子 (MET25) 的调控。2 mM 甲硫氨酸足以抑制启动子活性，而缺乏甲硫氨酸的培养基则允许基因最大程度表达。因此，可通过使用不同浓度的甲硫氨酸来实现目标蛋白水平的表达。质粒 DNA 在 W303 细胞中的转化采用 LiAc-TE 法，按照标准操作流程进行²。
   注意：本实验应通过在含有 2 mM 甲硫氨酸的培养基中过夜培养细胞，以确保蛋白表达仅处于本底水平。次日早晨，在细胞周期同步化后（约 4 小时），将细胞重悬于不含甲硫氨酸的培养基中以诱导蛋白表达。然而，我们发现只有当细胞内 ENTH2 蛋白积累到一定浓度后（通常在蛋白诱导 4–6 小时后³），才会诱导出依赖 ENTH2 的细胞分裂表型，这使得对表型所有表现形式的分析过程非常漫长（至少 16 小时）。我们发现，在含有 0.2 mM 甲硫氨酸的培养基中过夜培养细胞，虽可抑制形态学表型，但允许蛋白浓度达到亚临界水平，当转移至不含甲硫氨酸....

讨论

本方案描述了如何通过蛋白质过表达来监测形态学表型（酵母细胞无法正常进行细胞分裂）的发展过程。进行此操作时，重要的是要记住以推荐的离心速度离心收集酵母细胞，因为更高的速度可能会损伤细胞并掩盖实验结果。亚甲蓝和Calcofluor White应在成像前立即加入活细胞中，因为这些染料具有毒性。只要目标蛋白由可调控启动子驱动表达，该方案也可轻松适用于在蛋白质抑制条件下观察的表型。

....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
诺考达唑	试剂	Sigma-Aldrich	M1404
1% (w/v) 亚甲蓝	试剂	VWR international	VW6276-0
卡乐氟尔白	试剂	Sigma-Aldrich	F3543
凡士林	试剂	VWR international	VW3339-2