基因删除和蛋白质过表达是研究蛋白质功能的常用方法。本文中，我们描述了一种在群体水平和单细胞水平上分析酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中蛋白质浓度依赖性表型发育的实验方案。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
基因敲除和蛋白过表达是研究蛋白质功能的常用方法。在本文中，我们描述了一种在群体和单细胞水平上，作为蛋白质浓度函数分析表型发育的实验方案Saccharomyces cerevisiae. 尽管本实验方案基于蛋白质的过表达，但也可轻松调整用于依赖于蛋白表达抑制的形态学表型研究。我们实验室致力于研究内吞作用适配器蛋白epsin的信号传导特性。为此，我们采用了一种显性负性策略，即过表达其保守的EpsinN-TerminalH为了干扰内源性epsin-2（Ent2或YLR206W）的功能，我们表达了epsin-2的氨基末端同源结构域（ENTH结构域）。我们观察到，在野生型细胞中过表达Ent2的ENTH结构域（ENTH2）会导致细胞分裂缺陷，该缺陷依赖于一组支架蛋白——分裂素（septins）的错误定位。
方案
A. 细胞培养与蛋白诱导
本部分介绍了细胞培养条件、使用诺考达唑进行细胞周期同步化，以及随后在酵母细胞中通过可调控启动子诱导蛋白表达的方法。
- 将野生型酵母菌株 W303（leu2-3,112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11,15）用含有目的基因（ENTH2）的高拷贝（2μ）质粒 DNA 进行转化，该基因受甲硫氨酸可抑制启动子 (MET25) 的调控。2 mM 甲硫氨酸足以抑制启动子活性，而缺乏甲硫氨酸的培养基则允许基因最大程度表达。因此，可通过使用不同浓度的甲硫氨酸来实现目标蛋白水平的表达。质粒 DNA 在 W303 细胞中的转化采用 LiAc-TE 法，按照标准操作流程进行2。
注意：本实验应通过在含有 2 mM 甲硫氨酸的培养基中过夜培养细胞，以确保蛋白表达仅处于本底水平。次日早晨，在细胞周期同步化后（约 4 小时），将细胞重悬于不含甲硫氨酸的培养基中以诱导蛋白表达。然而，我们发现只有当细胞内 ENTH2 蛋白积累到一定浓度后（通常在蛋白诱导 4–6 小时后3），才会诱导出依赖 ENTH2 的细胞分裂表型，这使得对表型所有表现形式的分析过程非常漫长（至少 16 小时）。我们发现，在含有 0.2 mM 甲硫氨酸的培养基中过夜培养细胞，虽可抑制形态学表型，但允许蛋白浓度达到亚临界水平，当转移至不含甲硫氨酸的培养基时，蛋白水平可迅速上升至足以诱导表型的程度。这使得在相对较短的时间内即可对严重的细胞分裂缺陷表型进行详细分析。因此，我们建议实验人员根据具体情况确定诱导表型的亚阈值甲硫氨酸浓度。 - 从含有近期转化细胞的平板上挑取六个单克隆，使用标准无菌技术将其接种于 50 ml 含 0.2 mM 甲硫氨酸的筛选培养基中，置于灭菌的锥形瓶内。在 30°C、200 rpm 振荡条件下过夜培养。（有关标准酵母培养条件的更多信息，请参见参考文献 4）
- 次日早晨，通过测定培养物在 600 nm 处的光密度（OD）来估算细胞密度。取相当于 20 OD600nm 的细胞转移至无菌离心管中，在室温下以 2200 rpm 离心 5 分钟收集细胞。
- 将细胞重悬于 YPD 培养基中，浓度为 0.4 OD600nm/ml，并加入诺考达唑（Nocodazole），使其终浓度为 15 μg/ml（母液为 1 mg/ml 溶于 DMSO）。在 30°C、200 rpm 振荡条件下孵育 4 小时。
注意：也可采用其他阻滞方法，例如使用 α-因子阻滞于 G0 期，或使用羟基脲阻滞于 G1-S 期。我们发现，使用诺考达唑将细胞阻滞于有丝分裂期对本实验目的而言简便且有效。 - 孵育 4 小时后，通过显微镜观察具有大小相等芽体的细胞数量，计算处于有丝分裂阻滞状态的细胞百分比。若阻滞率超过 90%，则进行下一步操作；否则继续将细胞维持在诺考达唑处理中，直至达到理想的有丝分裂阻滞比例。
- 以 2200 rpm 离心 5 分钟收集细胞，用预冷的冰水洗涤三次。最后一次洗涤后，将细胞沉淀重悬于不含甲硫氨酸的筛选培养基中，细胞密度约为 0.5 OD600nm/ml。将一半体积的细胞转移至新的无菌离心管中，并加入甲硫氨酸至终浓度为 0.2 mM，作为基础表达水平蛋白效应的对照组。此时刻标记为实验的第一个时间点（时间 = 0 小时）。此后每小时取样分析一次，持续 6 小时。
B. 表型发育分析
注意：以下描述的所有分析方法无需同时进行。
通过蛋白质印迹法测定蛋白质表达水平
- 在每个时间点，测定培养物在600 nm处的光密度（OD600nm），并通过在2200 rpm下离心5分钟收集相当于2个OD600nm单位的细胞。
- 将沉淀重悬于1 ml无菌水中，并将悬液转移至1.5 ml离心管中。再次离心以获得沉淀，吸除上清液。
- 将沉淀重悬于50 μl SDS-PAGE Laemmli样品缓冲液（50 mM Tris pH 6.8，2% SDS，10%甘油，2% β-巯基乙醇和0.006%溴酚蓝）中。加入50 μl酸洗玻璃珠（直径0.2–0.4微米），涡旋振荡1分钟。
- 将离心管置于95°C金属浴中煮沸2分钟，再次涡旋30秒，继续煮沸5分钟。将蛋白样品在-20°C下冷冻保存。
- 将蛋白样品在12% SDS-PAGE凝胶上电泳分离，转印至硝酸纤维素膜，并使用适当的抗体进行Western blot检测目标蛋白。在此示例中，通过加入鼠源抗HA抗体（Covance，Princeton, NJ），在Blotto-Tween（1×PBS，5%脱脂奶粉，0.1% Tween）中以1:2000稀释，孵育检测带有血凝素（HA）标签的ENTH结构域。随后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠二抗（Pierce），同样以1:2500稀释于Blotto-Tween中，在室温下孵育1小时使其结合膜上的初级抗体。使用Supersignal West Pico化学发光底物检测HRP标记的抗小鼠抗体。
- 通过密度测定法对蛋白表达水平进行定量分析。
本部分介绍了两种根据蛋白质浓度增加来追踪表型发育的方法。第一种方法基于细胞群体，而第二种方法则在单细胞水平上进行研究。
细胞分裂表型和细胞死亡的定量分析
- 在每个时间点，使用无菌技术将 1ml 细胞悬液转移至无菌离心管中，并在 2200 rpm 条件下离心 5 分钟以收集细胞。
- 吸除上清液，将沉淀重悬于 70μl 培养基中，随后加入 30μl 亚甲蓝溶液（储存液浓度为 1mg/ml，溶剂为无菌水）。亚甲蓝是一种蓝色活体染料，在胞质的还原性环境中会褪为无色，因此死细胞因其呈现蓝色而可被识别。
- 用移液器吸取约 6μl 上述悬液滴加至洁净的玻璃载片上，盖上盖玻片，轻轻按压使细胞在两层玻璃之间形成均匀的薄层。
- 将盖玻片分为 9 个象限，按图 2 所示在每个象限采集 3 张图像。每个视野中的细胞数量不应超过 30 个，以确保准确量化。每张盖玻片在空气泡破坏样本前可维持约 15 分钟的成像时间。
- 统计显示目标表型的细胞数量。由于 ENTH2 过表达所诱导的细胞分裂缺陷会导致细胞死亡，因此我们同时统计因呈蓝色而被识别的死细胞数量。
- 计算具有表型的细胞百分比。
- 按图 3 所示方式绘制数据。
使用荧光显微镜观察表型特异性缺陷
在 ENTH2 过表达时观察到的细胞分裂缺陷细胞，通常表现出细胞壁缺陷和 Septin 蛋白错误定位（以 GFP 融合蛋白形式可视化）。芽殖酵母的细胞壁可通过 Calcofluor White（CfW）染色进行清晰观察，CfW 可与酵母细胞壁中的几丁质不可逆结合。
- 在每个时间点，取1 ml培养物至无菌离心管中，室温下以2200 rpm离心5分钟收集细胞。
- 将细胞沉淀重悬于100 μl含1 mg/ml CfW的无菌水溶液中，室温避光孵育5分钟。
- 离心收集细胞，并用1× PBS洗涤3次。
- 将沉淀重悬于100 μl 1× PBS中，使用显微镜在紫外光（细胞壁）和FITC滤光片（GFP-Septin）下以100倍放大倍数进行成像。
- 参照B.2.1节中步骤4–6，定量具有细胞壁缺陷和Septin错位的细胞百分比。
B.3. 单细胞水平表型发育的确定：延时视频显微镜观察。
- 用70%酒精清洁带有凹槽的载玻片，并使其自然晾干。
- 在无菌玻璃试管中，将0.06 g琼脂糖加入5 ml不含甲硫氨酸的选择性培养基中，用微波炉加热至琼脂糖完全溶解。
- 迅速将200 μl含琼脂糖的培养基移入载玻片的凹槽中，然后将另一张洁净的载玻片倒置覆盖其上，确保下方无气泡残留。
- 待凝胶凝固后，平稳地将上层载玻片从凹槽载玻片上移开，始终保持两片表面平行。此操作可确保琼脂糖表面与凹槽载玻片表面齐平。用柔软的擦拭纸清洁琼脂糖周围区域。载玻片现已准备就绪，可供使用。
- 在时间 = 4小时时，将1 ml培养物转移至无菌离心管中，在室温下以2200 rpm离心5分钟收集细胞。
注意：建议选择较晚的时间点，以确保蛋白表达水平较高，从而保证表型的充分发育。需通过预实验根据具体情况确定诱导时间。 - 吸除上清液，将细胞重悬于100 μl不含甲硫氨酸的新鲜选择性培养基中。
- 在盖玻片边缘涂抹凡士林。然后在琼脂糖表面中央滴加一滴细胞悬液，并轻轻盖上盖玻片，使其均匀铺展。
- 用凡士林密封盖玻片边缘，并用指甲油沿边缘涂覆以固定其位置。待指甲油完全干燥。
- 将载玻片置于显微镜加热台上，选择一个包含不超过10个细胞且分布足够分散的视野。随着细胞分裂，该视野将逐渐变得拥挤。
- 每5分钟拍摄一次该视野图像，持续约5小时。可通过ImageJ软件将图像序列合成为视频以观察表型进展（Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997-2005）
注意：我们使用蔡司Axiovert 200M显微镜、蔡司Axiocam MRm黑白数字相机以及卡尔·蔡司Axiovision图像采集软件（版本4.4）进行活细胞成像。温度控制通过将载玻片置于加热载物台上实现，该载物台由PeCon Tempcontrol 37设备维持在30°C。
为了避免反复重新调整焦距，可将图像采集软件设置为在每个时间点自动采集若干z轴层析图像，待后期拼接视频时再从中选择焦距最佳的图像。部分图像采集软件为时间序列实验提供自动对焦选项，若有此功能，建议使用。
野生型酵母细胞在 30°C 时生长最佳，因此温度控制至关重要。为了确保足够的热量，除了使用加热载物台外，提供外部热源会有所帮助。例如，我们在整个成像过程中始终保持显微镜透射白光开启。
在制备琼脂糖凝胶层和细胞夹心结构时，避免产生气泡也至关重要。气泡中截留的空气在长时间加热后会膨胀，容易将细胞推出成像区域。
在成像过程中，尤其是重新对焦时，确保视野内各个细胞的位置不发生明显变化也非常重要。ImageJ 提供了图像稳定插件，可用于校正视频组装后细胞位置的微小偏移。（http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本方案描述了如何通过蛋白质过表达来监测形态学表型（酵母细胞无法正常进行细胞分裂）的发展过程。进行此操作时，重要的是要记住以推荐的离心速度离心收集酵母细胞，因为更高的速度可能会损伤细胞并掩盖实验结果。亚甲蓝和Calcofluor White应在成像前立即加入活细胞中，因为这些染料具有毒性。只要目标蛋白由可调控启动子驱动表达，该方案也可轻松适用于在蛋白质抑制条件下观察的表型。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
感谢 Brian G. Coon 和 Claudia B. Hanna 提供的有益讨论与支持。 本项目得到了普渡大学生物科学系为 R. Claudio Aguilar 提供的启动资金，以及通过普渡大学癌症中心由美国癌症协会机构研究基金授予 R. Claudio Aguilar 的资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 诺考达唑 | 试剂 | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| 1% (w/v) 亚甲蓝 | 试剂 | VWR international | VW6276-0 | |
| 卡乐氟尔白 | 试剂 | Sigma-Aldrich | F3543 | |
| 凡士林 | 试剂 | VWR international | VW3339-2 |
参考文献
- Rönicke, V., Graulich, W., Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Use of conditional promoters for expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 283, 313-322 (1997).
- Gietz, R. D., Woods, R. A. High efficiency transformation with lithium acetate in Molecular Genetics of Yeast: A Practical Approach. , Oxford University Press Inc. New York. 121-134 (1994).
- Mukherjee, D., Coon, B. G., Edwards, D. F., Hanna, C. B., Longhi, S. A., McCaffery, J. M., Wendland, B., Retegui, L. A., Bi, E., Aguilar, R. C. The yeast endocytic protein Epsin 2 functions in a cell-division signaling pathway. J Cell Sci. 122, 2453-2463 (2009).
- Sherman, F. Getting started with yeast in Guide to Yeats genetics and Molecular Biology. , Academic Press Inc. San Diego. 3-21 (1991).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
