非洲爪蟾胚胎的塑料包埋与切片

摘要

塑料切片可在组织的薄切片中保持真实的组织形态，并可用荧光二抗进行免疫染色，因此该方法在多种组织类型中比石蜡包埋或冷冻切片更为实用。本视频展示了染色、塑料包埋及切片的方法。

方案

固定

1. 将完整胚胎或解剖得到的外植体转移至MEMFA或3.7% FA+PBS中，置于小玻璃闪烁瓶（Fisher货号 03-339-25B）内。在室温下将瓶置于旋转摇床中孵育，仅孵育2小时，不可超过此时间。胚胎在甲醛（FA）中停留不得超过2小时。甲醛孵育时间过长会导致胚胎组织变硬，从而影响后续检测过程中抗体的渗透效果。
   
   
2. 吸除大部分甲醛溶液，加入Dent's固定液至瓶口（约4.5 ml）。轻轻倒置瓶体数次，使胚胎在Dent's固定液中充分洗涤；随后更换为另4.5 ml新鲜Dent's固定液，并于-20ºC条件下孵育至少48小时。过夜孵育不足以完成此步骤。该步骤可提高胚胎对抗体的通透性。胚胎可在该条件下保存数周。

免疫荧光

1. 复水样本。将样本置于梯度甲醇溶液中孵育，步骤如下：
   
   

   75% MeOH/H2O	10min
   50% MeOH/PBS	10min
   25% MeOH/PBS	10min<....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PBS	缓冲液			1 L 配方：8.0 g NaCl，0.2 g KCl，2.68 g Na2HPO4·7H2O 0.2 g KH2PO4pH 应为 7.4。定容至 1 L。高压灭菌。
PBT	缓冲液			加入 0.5 mL Triton X-100 和 1.0 g BSA（分子生物学级，V 组分即可）[>99%]，但不要’t 使用粗制97%白蛋白）加入500 ml经高压灭菌的PBS中。用0.2 mm滤杯过滤。4℃保存ºC.
·凹痕’固定剂	试剂			将40 mL甲醇与10 mL DMSO混合。保存于 –20°C.
3.7% FA+PBS	试剂			将37%甲醛与PBS按1:9比例混合。每次使用前新鲜配制，剩余溶液丢弃。
辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 IgG（H+L）	Ab	Vector Laboratories	BA-9200
辣根过氧化物酶标记的兔IgG（H+L）二抗（山羊制备）	Ab	Vector Laboratories	BA-1000
免疫球蛋白’S HUADS 生物素 GTXRBT	Ab	Invitrogen	ALI3409	生物来源™
IgG (g)，山羊抗小鼠	Ab	Invitrogen	M30115	CALTAG™
荧光链霉亲和素试剂盒	试剂	Vector Laboratories	SA-1200	含有三种不同荧光染料标记的链霉亲和素（FITC、Texas Red 和 AMCA），适用于本实验步骤。
20% 山羊血清/PBT	缓冲液			这将用作封闭液。
小号画笔	工具
钝头解剖针	工具
Kulzer Technovit 7100 GMA，3040	试剂		7100 GMA，3040	甲基丙烯酸乙二醇酯
库尔策钨合金组织切片刀	工具	能量束科学	H1310
75% MeOH/H2O	缓冲液
50% 甲醇/PBS	缓冲液
25% 甲醇/PBS	缓冲液
30% EtOH/H22O	缓冲液
50% EtOH/H2O	缓冲液
75% EtOH/H2O	缓冲液
100% 乙醇	缓冲液
小型玻璃闪烁瓶	工具	Fisher Scientific	03-339-25B
0.5 mL 薄壁 PCR 管	工具	分子生物产品	3430
按压密封硅橡胶绝缘子	工具	Grace Bio-Lab 公司	JTR1L-2.5	32 mm 长 × 19 mm 宽，2.5 mm 厚
薄刃剃刀	工具
PBS 中的 1.5% 琼脂糖
针对抗原或表位标签的一抗：用PBT配制适当稀释度。 生物素偶联的二抗：多家供应商提供生物素偶联抗体。