塑料切片可在组织的薄切片中保持真实的组织形态，并可用荧光二抗进行免疫染色，因此该方法在多种组织类型中比石蜡包埋或冷冻切片更为实用。本视频展示了染色、塑料包埋及切片的方法。
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本文内容
摘要
方案
固定
- 将完整胚胎或解剖得到的外植体转移至MEMFA或3.7% FA+PBS中，置于小玻璃闪烁瓶（Fisher货号 03-339-25B）内。在室温下将瓶置于旋转摇床中孵育，仅孵育2小时，不可超过此时间。胚胎在甲醛（FA）中停留不得超过2小时。甲醛孵育时间过长会导致胚胎组织变硬，从而影响后续检测过程中抗体的渗透效果。
- 吸除大部分甲醛溶液，加入Dent's固定液至瓶口（约4.5 ml）。轻轻倒置瓶体数次，使胚胎在Dent's固定液中充分洗涤；随后更换为另4.5 ml新鲜Dent's固定液，并于-20ºC条件下孵育至少48小时。过夜孵育不足以完成此步骤。该步骤可提高胚胎对抗体的通透性。胚胎可在该条件下保存数周。
免疫荧光
- 复水样本。将样本置于梯度甲醇溶液中孵育，步骤如下：
75% MeOH/H2O 10min 50% MeOH/PBS 10min 25% MeOH/PBS 10min PBS 10min PBS 10min - 使用60 mm塑料培养皿制备1.5%琼脂糖/PBS平板。琼脂糖凝固后，在其表面加入PBS。
- 胚胎半切操作：将胚胎置于1.5%琼脂糖/PBS平板中。用镊子夹住一个胚胎，使用薄剃刀从胚胎中心纵向切为两半。选择切面平整且成功沿中线切开的样本。
- 将半切后的胚胎转移至含PBT的玻璃闪烁瓶中。更换为4.5 ml含20%山羊血清的PBT溶液。在摇床上室温孵育2小时（封闭步骤）。
- 在PBT中配制适当稀释倍数的一抗溶液，每份样本需0.5 ml。例如，为研究C-cadherin在5 mm塑料切片中的亚细胞定位，我使用了1/200稀释倍数的兔抗C-cadherin多克隆抗体。
- 吸除封闭液，加入0.5 ml稀释后的一抗溶液。将闪烁瓶直立放置于泡沫塑料管架上，在摇床上4ºC孵育过夜。
- 移除稀释后的一抗（该溶液可在接下来的1–2周内保存并重复使用）。在室温下用4.5 ml PBT洗涤4次，每次40–60分钟。
- 更换为0.5 ml PBT中1/100稀释的生物素标记二抗溶液。在摇床上4ºC孵育过夜。用铝箔包裹闪烁瓶以避免生物素暴露于光照。
- 自此步骤起，需注意避免样本暴露于光线下，即将闪烁瓶置于遮光容器或铝箔中。
- 移除生物素标记的二抗（该溶液亦可保存并在接下来的1–2周内重复使用）。在室温下用4.5 ml PBT洗涤4次，每次40–60分钟。
- 更换为0.5 ml PBT中1/200稀释的荧光标记链霉亲和素（如FITC、Texas-red等）溶液。在摇床上4ºC孵育过夜。
- 移除链霉亲和素溶液（也可重复使用）。在室温下用4.5 ml PBT洗涤3次，每次15–30分钟。
- 在4.5 ml含3.7%甲醛的PBS溶液中室温固定胚胎30分钟。
- 用4.5 ml PBS洗涤两次。
- 脱水样本。将样本置于梯度乙醇溶液中孵育，步骤如下：
30% EtOH/H2O 10 min 50% EtOH/H2O 10 min 75% EtOH/H2O 10 min 100% EtOH 10 min - 样本可在4ºC避光条件下保存于100%乙醇中。
浸润
- 配制Technovit 7100渗透混合液。通常取15 ml基础液于50 ml锥形管中，加入150 mg硬化剂I，置于摇床上以摇动方式混合15分钟。该渗透混合液可在4°C保存最多一个月。
- 使用渗透混合液对样本进行渗透处理，采用梯度系列的Technovit渗透混合液与乙醇（EtOH）组合进行置换，步骤如下：
- 50% Technovit/EtOH — 1小时
- 100% Technovit — 1小时
- 100% Technovit — 过夜
- 50% Technovit/EtOH — 1小时
- 样本可在100%渗透混合液中于4°C保存最多一个月。需对样本加盖，避免光照。
包埋
- 配制Technovit 7100包埋混合液：取0.75 ml浸润混合液至1.5 ml离心管中，加入50 µl硬化剂II。通过反复倒置离心管数次进行混匀。
- 使用塑料移液管，将经 overnight 浸润处理的一个样本转移至0.5 ml薄壁PCR管中，吸除大部分上清液。
- 向样本中加入0.25 ml本节第1步“包埋”中配制的包埋混合液。用钝头解剖针（木柄解剖针）轻轻推动，使剖开的胚胎切面朝向PCR管底部，以正确调整胚胎方位。
- 盖紧管盖，将PCR管置于避光处孵育约4小时，使塑料充分聚合固化。
- 配制Technovit 3040混合液：取1克粉末置于称量皿中，加入0.5 ml液体，立即使用蓝色枪头混匀。将混合液小心加至已固化的样本上方。此黄色的Technovit 3040可防止整个塑料块从PCR管中脱出。
切片
- 用二甲苯擦拭Histoknife H（乙醇通常效果不够好），然后将其安装到切片机上。将刀片角度调整至约 45°用二甲苯擦拭刀片前方的载物台区域，该区域的清洁度对切片质量至关重要。
- 用美工刀切开管子的侧面，然后剥下管尖。
- 将样本放入切片机的卡盘中。
- 在载玻片上贴附一个“按压密封”硅胶绝缘垫，以创建用于组织切片的封片腔室。在洁净台面上将绝缘垫牢固地按压到载玻片上，并从另一侧观察，确保绝缘垫完全贴合，无任何气泡。倒入洁净且预热的去离子水（dH₂O）。2O (~ 40°C用巴斯德移液管将液体滴加到载玻片的液滴中，直至液面达到可见其表面变平、不再呈凹面或凸面的水平。
- 开始制作切片。进行免疫荧光研究时，我制作5 mm的切片。 原位 杂交样品的切片厚度可根据实验目的和信号强度在约 3 - 8 mm 范围内调整。
- 用小号画笔将切片从刀片前方的载物台转移至盛有水的贴片室。将带有切片的画笔置于水面上方，用钝头解剖针轻敲使切片落入水中。切片一接触水面便会迅速展开成圆形。
- 当封片腔的大部分水面被切片占据时，使用巴斯德移液管吸走约一半的水分。将载玻片置于载玻片加热板上过夜孵育，使样本完全干燥。
- 用1 ml DAPI（0.1 mg/ml，溶于TE缓冲液）复染5分钟。吸除DAPI溶液，干燥样品。
- 从载玻片上移除硅橡胶绝缘层。现在可以对样品进行拍照。将样品保存于 4°C，避光保存。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| PBS | 缓冲液 | 1 L 配方：8.0 g NaCl，0.2 g KCl，2.68 g Na2HPO4·7H2O 0.2 g KH2PO4pH 应为 7.4。定容至 1 L。高压灭菌。 | ||
| PBT | 缓冲液 | 加入 0.5 mL Triton X-100 和 1.0 g BSA（分子生物学级，V 组分即可）[>99%]，但不要’t 使用粗制97%白蛋白）加入500 ml经高压灭菌的PBS中。用0.2 mm滤杯过滤。4℃保存ºC. | ||
| ·凹痕’固定剂 | 试剂 | 将40 mL甲醇与10 mL DMSO混合。保存于 –20°C. | ||
| 3.7% FA+PBS | 试剂 | 将37%甲醛与PBS按1:9比例混合。每次使用前新鲜配制，剩余溶液丢弃。 | ||
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 IgG（H+L） | Ab | Vector Laboratories | BA-9200 | |
| 辣根过氧化物酶标记的兔IgG（H+L）二抗（山羊制备） | Ab | Vector Laboratories | BA-1000 | |
| 免疫球蛋白’S HUADS 生物素 GTXRBT | Ab | Invitrogen | ALI3409 | 生物来源™ |
| IgG (g)，山羊抗小鼠 | Ab | Invitrogen | M30115 | CALTAG™ |
| 荧光链霉亲和素试剂盒 | 试剂 | Vector Laboratories | SA-1200 | 含有三种不同荧光染料标记的链霉亲和素（FITC、Texas Red 和 AMCA），适用于本实验步骤。 |
| 20% 山羊血清/PBT | 缓冲液 | 这将用作封闭液。 | ||
| 小号画笔 | 工具 | |||
| 钝头解剖针 | 工具 | |||
| Kulzer Technovit 7100 GMA，3040 | 试剂 | 7100 GMA，3040 | 甲基丙烯酸乙二醇酯 | |
| 库尔策钨合金组织切片刀 | 工具 | 能量束科学 | H1310 | |
| 75% MeOH/H2O | 缓冲液 | |||
| 50% 甲醇/PBS | 缓冲液 | |||
| 25% 甲醇/PBS | 缓冲液 | |||
| 30% EtOH/H22O | 缓冲液 | |||
| 50% EtOH/H2O | 缓冲液 | |||
| 75% EtOH/H2O | 缓冲液 | |||
| 100% 乙醇 | 缓冲液 | |||
| 小型玻璃闪烁瓶 | 工具 | Fisher Scientific | 03-339-25B | |
| 0.5 mL 薄壁 PCR 管 | 工具 | 分子生物产品 | 3430 | |
| 按压密封硅橡胶绝缘子 | 工具 | Grace Bio-Lab 公司 | JTR1L-2.5 | 32 mm 长 × 19 mm 宽，2.5 mm 厚 |
| 薄刃剃刀 | 工具 | |||
| PBS 中的 1.5% 琼脂糖 | ||||
| 针对抗原或表位标签的一抗：用PBT配制适当稀释度。 生物素偶联的二抗：多家供应商提供生物素偶联抗体。 |
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