激光显微切割技术应用于特定细胞亚群的基因表达谱分析 果蝇 翅盘

摘要

激光显微切割技术用于分析局部RNA干扰处理的果蝇翅盘特定区室中的基因表达谱 体内从沉默区与非沉默区的等效区域提取RNA，通过定量RT-PCR分析，以确定在天然组织微生态背景下基因表达谱的差异。

摘要

组织的异质性已被证明是限制从生物样本中获取信息量的一个因素，从而影响下游分析。鉴于许多组织内部存在复杂的动态细胞关联，为了通过分子分析充分重现体内的相互作用，必须能够在其原始微环境中分析特定的细胞群体。激光显微切割技术可实现这一目标，它能够在直接显微观察下，明确识别并成功分离感兴趣的细胞，同时保持分子完整性。我们已将该技术应用于分析发育中果蝇翅盘特定区域的基因表达，翅盘是研究生长调控、细胞分化和器官发生的理想模型系统。幼虫期成虫盘在发育早期即通过谱系限制边界被划分为前区与后区、背侧与腹侧区室。利用可诱导的GAL4-UAS双元表达系统，可在转基因果蝇中通过相应的GAL4驱动子调控UAS-GFP转基因的表达，从而特异性地标记各个区室。在转基因成虫盘中，可借助荧光GFP信号引导激光切割，对离散细胞亚群进行激光显微切割后，精确测定其基因表达谱。

在众多下游应用中，我们重点关注了局部RNA干扰（RNAi）后的RNA转录谱分析。随着RNAi技术的发展，GFP标记可与特定基因的局部敲降相结合，从而能够确定特定细胞群体在基因沉默条件下的转录响应。为验证该方法，我们在一个普遍表达的基因中对后部（P）区室进行区域性沉默，随后分离出由GFP表达标记的后部区室和未标记的前部（A）区室中对应的组织区域。从显微切割获得的沉默区与非沉默区分别提取RNA，并通过定量实时荧光定量RT-PCR进行比较基因表达谱分析。我们证明，该方法可有效应用于翅盘内特定细胞亚群的精确转录组学研究 果蝇 成虫盘。事实上，尽管通常将大量制备的成虫盘作为RNA来源并假定其细胞具有同质性，但众所周知，由于位置信息的影响，这些结构内部的转录表达可能存在显著差异。利用定位的荧光GFP信号引导激光切割，可实现更精确的转录分析，并可有效地应用于多种研究场景，包括在原位环境中对不同细胞谱系进行转录谱分析。

方案

第1部分. 特异且局部化RNAi处理的Drosophila成虫盘翅芽组织的制备。

在本实验中，我们使用的生物材料是来自转基因幼虫的Drosophila成虫盘组织，这些幼虫通过GAL4/UAS系统实现了特定区域的基因沉默¹。这些幼虫来源于两个亲本品系之间的遗传杂交：其中一个品系携带GAL4驱动元件，另一个品系携带UAS响应元件。驱动品系不仅可在特定的时间和/或空间模式下表达GAL4，同时还携带一个UAS-GFP报告基因，用于可视化GAL4的表达区域。UAS响应品系则在UAS序列的控制下表达一段可靶向目标基因（记为基因X）的发夹结构RNA（hpRNA），从而实现特异性沉默²。当hpRNA X在细胞内表达后，会被切割生成能够特异性沉默目标基因的小干扰RNA（siRNA）。在同时携带驱动和响应转基因的幼虫后代中，UAS介导的沉默结构仅在表达GAL4蛋白的细胞中转录，从而实现对目标基因X的空间限制性沉默。

在众多可能的应用中，我们采用该方法在engrailed-GAL4（en）驱动子的控制下，对一个选定的目的基因（基因X）进行沉默，该驱动子可在翅成虫盘后区室中引发特异性沉默³，该区域的范围由UAS-GFP转基因的表达标记。

将已沉默的成虫盘翅盘手工解剖分离，注意清除周围污染组织，尤其是附着的气管。每个分离出的翅盘随即迅速而轻柔地转移至预先处理过的无RNase解剖框中，以便立即对选定区域进行激光显微切割。

第2部分. 从翅盘中被沉默的（后部）和未被沉默的（前部）区室中进行激光显微切割选定区域。

当翅成虫盘置于膜上后，即可对沉默区域（后部；GFP标记）和非沉默区域（前部；无GFP标记）进行特定部位的激光显微切割。操作时绘制一个可同时容纳翅成虫盘GFP阳性侧和GFP阴性侧的区域。在显微切割仪下，我们首先将激光束聚焦于GFP阳性组织，沿选定的边界进行切割。显微切割仪以设定的速度和功率自动完成切割，但也可手动精细调整，直至所选组织区域落入下方收集管中。该收集管内含有少量TRI Reagent，以便GFP阳性组织可直接用于后续RNA提取。

随后，我们将切割区域移至翅盘中相反的、GFP阴性的一侧，以从未被沉默的GFP阴性组织中分离出相应的区域。再次完成自动切割后，我们继续手动优化切割边缘。切割完成后，GFP阴性组织也被收集至TRI试剂中，准备进行RNA提取。

第3部分. 从显微切割组织区域中提取RNA并进行转录谱分析。

我们将离心管旋转以使液体脱离管盖，并加入TRI Reagent至1 ml，随后按照标准的TRI Reagent方案进行RNA提取。为了收集足够的材料，我们对100个成虫盘进行了重复切割操作。从约100个区域（每个区域约5000 μm²）开始，共获得1.5 μg的RNA。随后通过RT-PCR检测沉默与未沉默样品中GFP的表达情况，以验证手动解剖的准确性，cDNA合成使用Super Script III（Invitrogen）并以随机六聚体引物进行。后续定量分析采用Real Time RT-PCR，利用Master Mix（Invitrogen）检测目标基因X的表达水平及其调控通路中潜在靶基因的表达情况。

讨论

根据在未沉默的翅成虫盘的前/后区室中达到的基础表达水平，发现所选基因X在沉默后其活性降低至40%。相反，其一个假定靶基因（基因Y）显著上调（增加7倍），由此我们验证了基因X负调控该靶基因的假设。

我们得出结论，上述实验方法可成功应用于验证多种调控通路的假定靶点。

此外，我们推测，提高RNA提取的得率可快速实现通过微阵列分析对局部转录谱进行表征，这将有助于更深入地了解重要的生物学过程。例如，形态发生梯度的局部形成^{4, 5}，或细胞竞争过程中潜在的转录转换⁶（其中可通过差异性GFP表达来可视化“失败”和“胜出”细胞克隆），均可得到更具体的研究。无论何种应用，该方法均有助于在天然组织环境中明确定义不同细胞区域的转录响应。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DEPC 水	Sigma-Aldrich	W4502
RNase Zap	Sigma-Aldrich	R2020
TRI试剂	Sigma-Aldrich	T9424
SuperScript III	Invitrogen	18080093
预混液	Invitrogen	11761100
琼脂糖	Sigma-Aldrich	A9539
异丙醇	Sigma-Aldrich	I9516
氯仿	Sigma-Aldrich	C7559
Dream Taq	Fermentas	EP0701
果蝇品系 果蝇UAS沉默品系可从VDRC RNAi品系库中获得 2. GAL4驱动品系的集合可从布卢明顿果蝇资源中心（印第安纳大学）获取, 美国 仪器设备 所需设备包括激光显微切割仪（Leica LMD6000）、Coulter Microfuge 22R（Beckman）、PCR仪（BIO-RAD My Cycler）、实时荧光定量PCR仪（BIO-RAD iQ5）。 工具 所需工具包括：玻璃凹玻片、毛刷、显微解剖镊、悬滴载玻片、固定在注射器针头上的昆虫针、带聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜的金属框架、塑料管（50 ml、05 ml、0.25 ml）。
果蝇UAS沉默品系可从VDRC RNAi品系库中获得 2. GAL4驱动品系的集合可从布卢明顿果蝇资源中心（印第安纳大学）获取, 美国 仪器设备 所需设备包括激光显微切割仪（Leica LMD6000）、Coulter Microfuge 22R（Beckman）、PCR仪（BIO-RAD My Cycler）、实时荧光定量PCR仪（BIO-RAD iQ5）。 工具 所需工具包括：玻璃凹玻片、毛刷、显微解剖镊、悬滴载玻片、固定在注射器针头上的昆虫针、带PET膜的金属框架、塑料管（50 ml、05 ml、0.25 ml）。
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所需设备包括激光显微切割仪（Leica LMD6000）、Coulter Microfuge 22R（Beckman）、PCR仪（BIO-RAD My Cycler）、实时荧光定量PCR仪（BIO-RAD iQ5）。 工具 所需工具包括：玻璃凹玻片、毛刷、显微解剖镊子、悬滴载玻片、固定在注射器针头上的昆虫针、带PET膜的金属框架、塑料管（50 ml、05 ml、0.25 ml）。
工具 所需工具包括：玻璃凹玻片、毛刷、显微解剖镊子、悬滴载玻片、固定在注射器针头上的昆虫针、带PET膜的金属框架、塑料管（50 ml、05 ml、0.25 ml）。
所需工具包括：玻璃凹玻片、毛刷、显微解剖镊、悬滴载玻片、固定在注射器针头上的昆虫针、带PET膜的金属框架、塑料管（50 ml、05 ml、0.25 ml）。